JAK2/STAT3/TWIST信號通路在子宮腺肌病上皮間質轉化中的作用研究*

錢 進,鄭艷莉

(1.南通大學附屬如皋人民醫院婦產科，江蘇南通 226500;2.南通大學第二附屬醫院/南通市第一人民醫院婦產科，江蘇南通 226000)

子宮腺肌病(adenomyosis，ADS)是指子宮內膜腺體和間質侵入子宮肌層[1-2]，且周圍肌細胞伴有代償性增生和肥大的特征，是一種具有惡性腫瘤特點的良性婦科疾病，也是現代婦科常見疾病之一，發病率高達21.5%。想要闡明ADS的發病機制，需要明確子宮內膜上皮細胞是如何向肌層發生遷移和侵襲的，這也是近年來的研究熱點和難點，現有大量研究發現上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與上皮細胞如何向間質細胞發生功能轉變[3]，繼而獲得遷移侵襲能力息息相關。

EMT是一個復雜的多步驟過程[4]，是多種細胞外信號與細胞內的EMT下游信號通路及參與該過程的轉錄因子共同組成的復雜的信號網絡，包括多條信號通路。在不同的細胞內，這些信號通路的重要性各有不同。其中JAK/STAT3/TWIST信號通路是近年來研究發現的一條由細胞因子激活的信號傳導通路，主要參與細胞的増殖、凋亡及免疫調節。JAK/STAT3/TWIST信號通路的激活，在慢性炎癥和免疫抑制過程中起關鍵作用。研究發現，在多種細胞系中可以通過激活JAK/STAT3/TWIST信號通路，提高間質細胞標志性蛋白N-cadherin和Vimentin表達，而E-cadherin表達下調，從而促進了EMT的形成，可以說JAK/STAT3/TWIST信號通路是EMT形成過程中被激活的關鍵信號傳導通路[5-6]。本研究探討JAK2/STAT3/TWIST信號通路在ADS EMT中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年3月至2021年3月南通大學附屬如皋人民醫院就診的35～55歲患者。因ADS行全子宮切除術且術后病理證實為ADS病例50例為試驗組，所有患者均留取在位內膜及異位內膜組織，一部分組織福爾馬林固定待后續病理和免疫組織化學實驗，另一部分組織-80 ℃凍存待后續分子實驗。因子宮肌瘤行全子宮切除術且術后病理證實無子宮內膜病變病例50例為對照組，取正常子宮內膜組織。排除標準：有生殖器官惡性腫瘤疾病；近半年服用激素類藥物；產后哺乳期；合并各種內外科嚴重疾病。本研究經南通大學附屬如皋人民醫院批準(LW2110)，患者知情同意。

1.2 主要試劑

一抗E-cadherin 抗體(英國Abcam公司，ab40772)、N-cadherin 抗體(美國Proteintech公司，66219-1-lg)、JAK2 抗體 (美國Proteintech公司，17670-1-AP)、STAT3抗體(美國Proteintech公司，60199-1-lg)、TWIST2抗體(美國Proteintech公司，66544-1-lg)，二抗Rabbit anti-β-actin抗體(上海碧云天生物技術有限公司，AF0003)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，AR1022)，聚合HRP標記抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司，SV0001)，聚合HRP標記抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司，SV0002)，逆轉錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，R223-01)，SYBR-Green Master PCR Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Q711-02/03)

1.3 方法

1.3.1石蠟切片

新鮮組織福爾馬林固定48 h。乙醇梯度脫水，二甲苯透明后浸蠟。制作組織石蠟塊，石蠟切片厚度4 μm，65 ℃烤片1 h。

1.3.2HE染色觀察病理變化

二甲苯3次各10 min，乙醇梯度脫蠟各5 min，蒸餾水5 min。蘇木素染色2 min，1%鹽酸乙醇分色1 s，水洗藍化20 min。50%乙醇5 min，70%乙醇5 min，80%乙醇5 min，伊紅染色2 s。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，封片。

1.3.3免疫組織化學染色觀察E-cadherin、N-cadherin、JAK2、STAT3、TWIST的定位

切片脫蠟至水。H2O2孵育10 min，PBS洗5 min×3次。枸櫞酸鹽抗原熱修復，PBS洗5 min。5% BSA 37 ℃孵育30 min。滴加一抗(E-cadherin、N-cadherin抗體1∶250稀釋，JAK2抗體1∶50稀釋，STAT3抗體1∶50稀釋，TWIST抗體1∶250稀釋)。4 ℃孵育過夜。PBS洗5 min×3次，二抗37 ℃孵育30 min。PBS洗5 min×3次，DAB顯色，蒸餾水終止顯色。蘇木素復染2 min。梯度脫水和透明，封片，隔天拍照。先低倍鏡觀察，選擇目標區域高倍鏡下，隨機觀察5個視野，陽性表達呈棕黃色。

1.3.4Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin、JAK2、STAT3、TWIST蛋白表達

常規方法提取蛋白。配制分離膠及濃縮膠。蛋白上樣量為200 μg。電泳先80 V再120 V。300 mA 90 min轉膜。室溫封閉2 h。一抗(E-cadherin、N-cadherin抗體1∶2 000稀釋，JAK2抗體1∶500稀釋，STAT3抗體1∶1 000稀釋，TWIST抗體1∶2 000稀釋)4 ℃過夜，PBST洗10 min×3次。二抗(1∶2 000稀釋)室溫90 min，PBST洗20 min×3次。ECL顯色。

1.3.5qRT-PCR檢測JAK2、STAT3、TWIST mRNA表達

Trizol法提取總RNA。根據試劑盒說明書行逆轉錄反應和QRT-PCR。JAK2：上游引物5′-TCG CTG CCG AGG GAT GTG AG-3′，下游引物5′-TCT TGT TCC TGT TGC CTG CTT CTG-3′；STAT3：上游引物 5′-GAG GCA GGA GAA TCG CTT GAA CC-3′ 下游引物5′-TCT CAG ACT GTC GCC CAG GAT G-3′；TWIST：上游引物5′-CCA TCC TCA CAC CTC TGC ATT CTG-3′，下游引物5′-GGC TGA TTG GCA CGA CCT CTT G-3′；GAPDH：上游引物5′-ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG-3′，下游引物5′-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3′。反應體系：2×SYBR mix 10 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應條件：95 ℃ 5 min 預變性；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共45個循環；溶解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。使用2-ΔΔCT法進行相對定量分析。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 HE染色觀察ADS病理結構

正常內膜組織無明顯異常；在位內膜組織內膜腺體和間質與肌層分界清晰，內膜未入侵肌層；異位內膜組織細胞排列紊亂，細胞核和細胞質均著色較淺，子宮內膜腺上皮與間質細胞侵入子宮肌層且形成增生見圖1。

圖1 HE染色觀察ADS病理結構

2.2 免疫組織化學染色觀察EMT相關標志物E-cadherin、N-cadherin的定位

E-cadherin、N-cadherin均特異性表達于子宮內膜上皮細胞的細胞膜上,見圖2。在位內膜和異位內膜中E-cadherin表達較正常內膜明顯降低，且異位內膜表達弱于在位內膜，E-cadherin在異位內膜中染色呈淡黃色，為弱陽性表達。在位內膜和異位內膜中N-cadherin表達較正常內膜明顯升高，且異位內膜表達強于在位內膜，N-cadherin在異位內膜中染色呈棕黃色，為強陽性表達。

圖2 E-cadherin、N-cadherin在正常內膜、在位內膜和異位內膜中的表達分布

2.3 Western blot檢測EMT相關標志物E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

與正常內膜比較，在位內膜、異位內膜中E-cadherin蛋白表達降低(P<0.01)，在異位內膜中下降更明顯(P<0.01)；在位內膜、異位內膜中N-cadherin蛋白表達升高(P<0.01)，在異位內膜中升高更明顯(P<0.01)，見圖3。

A： 蛋白印跡圖；B：E-cadherin蛋白表達；C：N-cadherin蛋白表達。

2.4 qRT-PCR 檢測JAK2、STAT3、TWIST mRNA表達

與正常內膜比較，在位內膜、異位內膜中JAK2/STAT3/TWIST mRNA表達升高(P<0.01)，在異位內膜中升高更明顯(P<0.01)，見圖4。

A：JAK2 mRNA表達；B：STAT3 mRNA表達；C：TWIST mRNA表達。

2.5 Western blot檢測JAK2、STAT3、TWIST的蛋白表達

與正常內膜比較，在位內膜、異位內膜中JAK2、STAT3、TWIST蛋白表達升高(P<0.01)，在異位內膜中升高更明顯(P<0.01)，見圖5。

A：蛋白印跡圖；B：JAK2蛋白表達；C：STAT3蛋白表達；D：TWIST蛋白表達。

2.6 免疫組織化學染色觀察JAK2、STAT3、TWIST定位

JAK2、STAT3、TWIST主要特異性表達于細胞質中，見圖6。在位內膜和異位內膜中JAK2、STAT3、TWIST表達較正常內膜明顯升高，異位內膜表達強于在位內膜，JAK2、STAT3、TWIST在異位內膜中染色呈棕黃色，為強陽性表達。

圖6 JAK2、STAT3、TWIST在正常內膜、在位內膜和異位內膜中的表達分布

3 討 論

ADS是現代婦科常見的良性疾病，也是常見的不孕原因之一[7]。ADS雖然是良性疾病，但其生物學特性具有惡性腫瘤的特質，即可以遷移和侵襲，且極易復發[8]。

正常子宮內膜組織中的細胞主要是上皮細胞，其具有極性，特征是細胞與細胞之間存在相對緊密的連接，這對維持組織結構完整性和協調細胞功能有重要意義。而間質細胞是間質及結締組織的主要組成成分，其結構松散，相對沒有極性，移動性較高。這兩類細胞不僅形態上，蛋白表達和功能更是有所差異。ADS正是上皮細胞的減少，間質細胞的異常增多。ADS子宮內膜特性的改變與EMT過程密切相關[9-10]，包括細胞外基質降解、細胞運動、細胞黏附和血管生成等因素，提示EMT可能參與ADS的發生和發展。在形態學方面，正常子宮內膜上皮細胞具有規則且較大的細胞核，并且細胞和細胞之間排列規整和連續，而ADS子宮內膜上皮細胞間的排列中斷[11]。ADS上皮細胞由橢圓形轉變為長梭形，呈成纖維細胞樣。子宮內膜上皮細胞形態的改變使細胞間接觸不穩定，形成更易遷移和侵入的間質表型。在分子表達方面，CAI等[12]報道，在ADS異位病灶中，EMT標志物E-cadherin表達降低且Vimentin表達升高，而E-cadherin轉錄抑制因子Snail表達升高，促進ADS的發生和發展。在生物學功能方面，ADS是子宮內膜細胞侵襲性增強的結果，由于在子宮內膜和子宮肌層之間沒有基底膜，組織應激損傷或局部組織炎癥引發EMT過程[13]。隨著ADS持續的過度活動和慢性損傷，內膜細胞持續增殖和慢性炎癥進一步延緩了愈合過程，并導致病灶數目增加[14]。

本研究為了明確ADS中是否確實存在EMT現象，收集ADS患者在位和異位內膜組織，且術后病理證實無其他病癥，并選取同期子宮肌瘤患者且病理證實無病變的子宮內膜組織作為對照。本研究結果發現E-cadherin和N-cadherin均特異性表達于細胞膜上。與正常內膜比較，在位內膜、異位內膜中E-cadherin表達降低、N-cadherin表達升高，異位內膜變化更明顯。這正是EMT發生的分子表達特征，說明EMT可能參與了ADS的發病過程。

JAK/STAT信號通路最初是在研究干擾素對細胞的作用機制時被發現的[15]，JAK 屬于非受體酪氨酸激酶，STAT則是信號轉導和轉錄激活因子的統稱。人體內幾乎所有的細胞都有表達 JAK[16]，在正常個體的胚胎發育進程中必不可少，并在各類細胞中廣泛表達，催化多種細胞因子誘導的免疫反應。細胞因子的水平、細胞膜上不同受體的表達差異，使得 JAK2/STAT3 活化后對免疫反應和炎癥的雙向調節作用，既可增強免疫反應又可抑制免疫反應，維持正常的免疫穩定狀態。STAT3的下游因子TWIST是堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子家族成員之一[17]，其在胚胎發育過程中起著調節細胞遷移的作用，它可以使上皮細胞轉化為間充質細胞，使細胞具有遷移轉移的能力[18]。大量研究表明，TWIST是誘導EMT發生的關鍵性調控因子和始動因素[19]。TWIST作為EMT的主要轉錄因子，通過誘導EMT，使上皮細胞間連接橋梁E-cadherin的表達減少，從而增強了腫瘤細胞的侵襲性和轉移力，是EMT過程中的正性調節因子。TWIST還可以作為凋亡抑制蛋白參與EMT過程，促進細胞遷移、侵襲、抗凋亡等，TWIST可通過抑制E-cadherin表達和誘導N-cadherin表達來調節EMT過程。還有研究發現，TWIST在子宮內膜異位癥(EMs)的發病機制中也扮演了重要角色[20]，在EMs中TWIST的表達明顯上調，可能是通過誘導EMT引發的EMs。

本實驗通過qRT-PCR、Western blot、免疫組織化學從基因表達、蛋白表達、定位檢測JAK2、STAT3、TWIST在正常內膜、在位內膜、異位內膜中的表達，發現無論是基因表達還是蛋白表達，其表達趨勢一致，均特異性表達于細胞質中，且與正常內膜比較，在位內膜、異位內膜中JAK2、STAT3、TWIST表達升高，異位內膜變化更明顯。可見JAK2/STAT3/TWIST信號通路的激活與ADS的發生密切相關，且可能促進了ADS中EMT的發生。但JAK2/STAT3/TWIST信號通路又是如何促進ADS中EMT的發生，它們之間又是如何協調的，其機制還有待進一步深入研究。