猴頭菌固體發酵技術及其對發酵產物中生物活性物質影響研究進展

李昕陽，冷 悅，陸 珠，王 旭，陳長寶，王 歡*

（1.長春中醫藥大學 吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130000；2.吉林省蔬菜花卉科學研究院，吉林 長春 130000；3.延邊朝鮮族自治州農業科學院，吉林 龍井 133400）

猴頭菌（Hericium erinaceus）隸屬擔子門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）紅菇目（Russulales）猴頭菌科（Hericiaceae）猴頭菌屬（Hericium）[1]，也稱為猴頭蘑、羊毛菌、猴頭菇等[2]。我國猴頭菌屬共有4個種，除了猴頭菌外還有3個近緣種：小刺猴頭菌、假猴頭菌和珊瑚狀猴頭菌[3]。猴頭菌屬于腐生菌，野生猴頭菌多生長在闊葉樹木的腐木和立木受傷處，主要分布于東北大興安嶺，西北天山和新疆阿爾泰山等森林茂密之地。猴頭菌是我國著名的藥食兩用真菌，據《中國藥用真菌》記載猴頭菌性平，味甘，能利五臟，助消化，有滋補抗癌、治療神經衰弱之功效[4]。另有大量臨床數據表明，猴頭菌在防治消化不良、慢性胃炎、胃潰瘍等疾病方面療效顯著[5]。除此之外，國內還將猴頭菌開發成飲品、餅干、沖劑等形式多樣的食品和保健品，備受消費者青睞，具有廣闊的消費市場和良好的發展前景。

固態發酵（solid-state fermentation，SSF）是指在固態基質原料上進行的微生物發酵過程[6]，培養基底物以固態形式存在，不溶于水，為微生物提供了生長環境和所需的營養物質[7]。固體發酵技術在我國有非常悠久的歷史，如醬油、食用醋、白酒等。隨著現代生物技術的發展，發酵在人類生活的各個方面都得到了應用，近年來利用食用菌進行固態發酵的研究也逐漸增多，探究食用菌菌絲體的潛在價值也成了新的研究熱點[6]。何斌[8]采用雙向固體發酵工程技術，以靈芝為出發菌株，以丹參藥材為發酵基質，對菌株適應性、菌質藥效與安全性進行篩選和發酵工藝的優化，研究結果顯示靈芝酸三萜的含量顯著增高。李慧星等[9]使用山藥和蛹蟲草進行雙向固體發酵，發酵過程中山藥中的多糖、纖維素等糖類物質被蛹蟲草利用轉化出山藥中原來不存在的多酚類和皂苷類物質，同時，山藥作為菌質，經發酵后其抗氧化活性也顯著提高。翟飛紅等[10]采用姬松茸和雙孢蘑菇對小米進行固態發酵，提高了小米的蛋白質質量和多酚含量。該文綜述了猴頭菌固體發酵技術，介紹發酵基質的選擇和發酵條件的調控，并對猴頭菌固體發酵產生的以猴頭多糖類、黃酮類和二萜類為主的三類活性物質含量的變化及影響因素進行歸納整理和闡述分析，以期為猴頭菌固體發酵技術的研究提供參考。

1 猴頭菌固體發酵技術

液體發酵作為傳統的發酵方式，具有發酵周期短、占地面積小等優點，但同時存在易污染、提取活性物質成本高以及廢水處理等問題[11-12]。相比而言，固體發酵技術生產成本低經濟效益高，此外，固體發酵可提供類似自然界發生微生物反應的環境，利于發酵物進行生物轉化，產生豐富的生物活性物質[13]。

目前國內外針對猴頭菌固體發酵技術方面的研究開展較少，國內主要聚焦于猴頭多糖的藥理活性及提取工藝優化等方向，亦或是作為一種藥性基質對人參[14]、青稞[15]、玉米[16]等中藥或作物的生物轉化作用。國外則較為關注猴頭菌素對消化系統及神經系統[17-18]的保護作用，尤其以猴頭菌素A（erinacine A，Er A）對以帕金森、阿爾茲海默癥等為主的神經系統老化[19-20]類疾病的改善作用。

1.1 發酵基質的選擇

猴頭菌固體發酵可選的培養基質種類繁多，包括大米[21]、糯米[22]、糙米[23]、玉米[13]、大豆粉[21]、木屑[24]、人參等[14]，這些原料為微生物的生長提供碳水化合物、蛋白質、粗纖維、脂肪以及微生物和無機鹽，為猴頭菌發酵提供底物[7]。與單菌株發酵相比，混菌發酵可以發揮多種細菌和酶的綜合作用，提高發酵效率、更豐富的發酵產物和更多的可能性，尤其是藥用真菌和益生菌混合發酵[14]。

張新超等[21]選用燕麥、大豆、玉米、麩皮、大米、蕎麥六種培養基對猴頭菌進行固體發酵和抗氧化活性的研究。將發酵后生物量作為評價標準，以蕎麥大豆培養基為猴頭菌最佳發酵基質，研究結果表明，經發酵總多酚含量、內源性抗氧化物質超氧化物歧化酶活性都明顯提高。張鵬等[22]對漢麻秸稈的添加量進行探討，以期替代常規配方中的闊葉木屑來栽培珊瑚猴頭菌，研究結果發現，與常規配方相比，當漢麻秸稈添加量為60%時，菌絲生長最旺盛、生長周期最短，生物學效率和粗蛋白含量最高。唐敏等[14]以猴頭菌為發酵菌種，人參為藥性基質進行雙向固體發酵，探究發酵菌質組和藥性基質組不同發酵時期的多糖、蛋白質含量和抗氧化能力的變化。研究結果表明，猴頭菌與人參雙向固體發酵后，菌質中活性物質的抗氧化能力得到明顯提升。關于猴頭菌基質的選擇主要取決于目標產物的選擇，若為擴大生產可選用漢麻秸稈、蕎麥大豆等作為培養基；若為提高代謝產物的含量和抗氧化能力則可以選擇人參、大米等基質。

1.2 猴頭菌固體發酵條件的選擇

影響猴頭菌固體發酵的因素包括發酵時間、發酵溫度、初始pH值、含水量、碳源氮源的選擇及碳氮比等因素[7]。在微生物的生長過程中，溫度對蛋白質合成酶和細胞活性以及代謝產物的合成都是非常敏感的，因此在固體發酵中溫度的控制極其重要[25]；不同發酵時段的活性物質含量各不相同，如Er A只存在于菌絲體中，所以發酵時間的選擇也至關重要[27]；除此之外，在固體發酵過程中，由于代謝活動的影響，發酵環境的pH值會隨之發生一定的變化，既可以直接影響菌絲體生長，也可間接通過影響發酵基質的物理、化學和生物學特性進一步影響菌絲體的生長發育，具體表現在菌絲體的形態外觀，物質代謝和產量等方面[25]。

1.2.1 發酵溫度的選擇

盛悅[16]利用玉米蛋白粉發酵猴頭菌，在對培養基進行優化時將培養溫度分別設定為23 ℃、24 ℃、25 ℃、26 ℃、27 ℃，以多糖產量和菌絲體生物量為評價指標，最終確定25 ℃為培養基的最適溫度。楊彤等[26]以長白山野生珊瑚狀猴頭菌菌株作為研究對象，進行單因素試驗得出，理想的pH為3.5～4.0，溫度為20～22 ℃，在此基礎上進行正交試驗，發現溫度對珊瑚狀猴頭菌的影響程度最大，最佳發酵溫度為20 ℃。SUN S K等[23]為了測試猴頭菌的最適生長溫度，將接種有猴頭菌菌絲的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）平板分別在5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃下培養30 d，結果發現，最適溫度為25 ℃。

在不同發酵基質、發酵時間、pH值等因素的影響下，猴頭菌固體發酵的最適溫度略有出入，但大部分情況下，20～25 ℃最適宜猴頭菌生長，菌絲體生物量最高，當發酵溫度低于15 ℃或超過30 ℃時，由于細胞活性和蛋白質合成受到抑制[16]，菌絲的生長速度和生物量都會出現不同程度的降低和減少。

1.2.2 發酵時間的選擇

盛悅[16]在利用玉米蛋白粉發酵猴頭菌時對固體發酵的時間也進行了優化，將發酵時間分別設定為12 d、13 d、14 d、15 d、16 d，在最適培養溫度、接種量、初始pH值以及已經優化的培養基配方的基礎上對發酵時間進行優化，結果表明，發酵時間為15 d時菌絲的生物量和多糖產量均達到最高，分別為0.173 5 g/g、5.337 4 mg/g。SUN S K等[23]利用小麥固體發酵猴頭菌，在此基礎上研究發酵產生的活性物質對斑馬魚胚胎腦細胞的保護和修復作用。選擇0、21 d、28 d、35 d、42 d、56 d對培養時間進行優化，結果表明，發酵至35 d時猴頭菌中的粗多糖和粗三萜含量最高，分別可達15.65%和0.153%，發酵至56 d時Er A含量最高，為0.062%。PATOCKA J等[27]利用木屑、大米和玉米麩作為固體培養基對猴頭菌進行發酵，以探討猴頭菌不同生長時期的生物活性物質含量。發酵時間分別設定為14 d、21 d、28 d，研究結果表明，發酵至14 d時麥角甾醇和猴頭菌素C（erinacine C，Er C）含量最高，分別為3.54 mg/g 和1.23 mg/g。

綜上，一方面，猴頭菌的最佳發酵時間會受到不同培養基的影響；另一方面，最佳發酵時間也要根據目標發酵產物進行優化，不同的活性物質對發酵時間的要求不同，但一般發酵至15～20 d時，猴頭菌生物量可達到最大。發酵時間過長菌體進入衰亡期[16]，生物活性物質不再進行積累反而開始消耗，發酵時間過短菌體尚未進入成熟期，不論是菌絲生物量還是生物活性物質含量都達不到最大值。因此最佳發酵時間的選擇要綜合考慮到培養基配方、發酵條件、菌種活力以及目標產物的要求。

1.2.3 初始pH值的選擇

張新超等[21]利用蕎麥和大豆對猴頭菌的固體發酵條件進行優化，將初始pH值分別設定為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以發酵后基質的2,2'-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS+）自由基清除率為評判標準，結果表明，初始pH值為5.0時ABTS+自由基清除率超過50%，為最佳初始pH值。盛悅[16]通過單因素試驗將初始pH值設定為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，發現pH值在4.0～5.0之間時，隨著pH值的增加，多糖產量、菌絲體生物量隨之增加且增速較快，然而當pH＞5.0時則相反。在此基礎上開展正交試驗，顯示當pH值為5.5時，多糖含量和菌絲生物量均達到最高，分別為4.346 mg/g和0.133 g/g。楊彤等[26]在PDA培養基上培養珊瑚狀猴頭菌，采用10%NaOH溶液和10%HCl溶液將培養基的pH調節至3.0、3.5、4.0、5.0、6.0等5個梯度，根據菌絲的長速和長勢以及培養基的性質，綜合判斷珊瑚狀猴頭菌絲生長的適宜pH，結果顯示，當pH值為3.5～6.0之間時，猴頭菌的生物量和菌絲量最高，且差異性較小。

綜上所述，培養基的選擇對最優初始pH值的選擇影響較小，初始pH值的選擇主要與真菌的習性有關，猴頭菌偏好弱酸性培養基，由于發酵過程中會不斷分泌有機酸，后期基質會呈現過度酸化，抑制菌絲的生長[25]，因而最佳初始pH值一般控制在4.0～6.0之間，利于菌絲體的生長和生物活性物質的積累。

2 猴頭菌固態發酵產物中生物活性物質的變化

猴頭菌作為我國著名的藥食兩用真菌，富含蛋白質、氨基酸、多種礦物質和維生素等多種營養物質，除此之外還含有多糖[29]、肽類、萜類、甾醇類以及醇類等生物活性物質[30]，對治療慢性胃炎、胃潰瘍及十二指腸潰瘍都有顯著效果[31]，具有增強免疫[30]、降血糖[32]、延緩衰老[33]、促進神經發育[30]等多種生理功能，具有極高的研究價值和意義。

2.1 多糖類化合物

猴頭菌多糖是著名的真菌多糖之一，由多種成分組成[29]。在抗炎、抗潰瘍、抗氧化、提高機體免疫力等方面都有較好的功效。猴頭菌多糖抗潰瘍的機理在于它能增強胃黏膜屏障機能[29]，對潰瘍表面細胞起到再生和修復作用[34]。石祥生[35]研究結果表明，猴頭菌多糖能夠提高巨噬細胞的吞噬能力，增強自然殺傷細胞的活性，還發現猴頭菌多糖有一定的免疫調節和免疫增強作用。賈冬舒等[36]研究發現，猴頭菌多糖可以通過激活超氧化物歧化酶的活性抑制機體的氧化反應，從而達到抗衰老的功效。韓愛麗[32]研究發現，珊瑚狀猴頭菌通過抑制膽固醇合成降低血漿中的膽固醇，通過促進低密度脂蛋白受體阻止膽固醇從腸道吸收，促進膽汁酸合成的限速酶的有效表達來促進膽酸或膽固醇的排出。蔡楊星等[37]分別以菌草和木屑作為基質固體發酵猴頭菌，試驗結果表明，菌草栽培和木屑栽培的猴頭菌，其多糖含量均在菌蕾期達到高峰，分別達到78.99 g/L和83.63 g/L，然而在成熟期和衰老期則呈現逐漸下降的趨勢。盛悅[16]在利用玉米蛋白粉對猴頭菌進行固體發酵時，對超聲輔助提取工藝進行優化，經固體發酵和優化后多糖得率為5.84%，相對于傳統熱水浸提法，多糖得率提高了50.52%。喬莉[38]對固體培養基進行優化和篩選，最終選定玉米和薯渣作為猴頭菌固態發酵的培養基質，同時對猴頭多糖的提取工藝進行優化，提取率為2.504%，野生猴頭菌的多糖提取率是經固體發酵的猴頭菌的2倍。曲明清等[39]的研究顯示，野生猴頭菌子實體平均含量為（4.68±0.10）g/100 g，高于人工栽培猴頭菌子實體多糖含量1.22%。朱伶俐等[40]研究表明，不同基質配方對猴頭菌子實體多糖分子質量及分布較為相近，然而各組分所占比例間的差異則較為明顯。這提示關于猴頭菌固體發酵配方與產糖之間的關系仍需進一步明確。

猴頭菌經固體發酵后猴頭多糖含量的變化除了與發酵基質、發酵參數等有關外，還與提取工藝的水平有很大關系。因此，關于猴頭菌固體發酵技術和猴頭多糖的提取技術仍需改進與優化。

2.2 黃酮類化合物

黃酮類化合物是植物的次生代謝產物，種類繁多，結構復雜[41]，基本母核為2-苯基色原酮[42]。黃酮類化合物因其獨特的化學結構對人類的腫瘤、衰老、心血管病等退行性疾病的治療和預防有著重要的意義[43]。除此之外，還有大量研究表明，黃酮類化合物有提高動物機體抗氧化及清除自由基的能力[44]。喻凱[45]研究表明，猴頭菌中的黃酮類化合物有抗胃腸道腫瘤的作用，在有效部位含有多種不同黃酮，在抗腫瘤的過程中發揮重要作用。INANAGA K[46]研究顯示，猴頭菌中提取出的杏仁烯酮可以通過血腦屏障，誘導神經生長因子合成，抑制β-淀粉樣肽的細胞毒性，以及抵抗神經細胞由于氧化和內質網應激而導致的死亡。馬賀等[15]在用青稞固體發酵猴頭菌時發現，游離態黃酮含量呈現先降后升再降的波動變化，而結合態黃酮和總黃酮含量則相反，呈現先升后降再升的表現。猜測可能與發酵過程中猴頭菌對游離態黃酮的酶解和利用有關。王世新[43]利用沙棘固體發酵猴頭菌，對配方進行優化后測定該配方的猴頭菌黃酮含量為7.42 mg/g，相比對照而言，提高了37.64%。張新超等[21]選用燕麥、大豆、玉米、麩皮、大米、蕎麥6種基質對猴頭菌進行固體發酵，結果發現，蕎麥大豆混合培養基為最佳發酵基質，發酵后總黃酮物質含量為87.13 μg/g，與發酵前相比，總黃酮含量呈現下降狀態，可能與猴頭菌生長代謝有關。這與馬賀等[15]研究結果相反，可能與發酵基質的選擇和發酵時間的控制有關。綜上，關于猴頭黃酮的含量與固體發酵之間的關系仍需進一步探尋，包括猴頭菌開始酶解利用黃酮類物質的界點和猴頭菌酶解和利用黃酮類物質的機理。

2.3 二萜類化合物

二萜類物質由4個異戊二烯單位組成，在自然界中存在較少。AYER W A等[47]研究發現，發酵鳥巢菌科黑蛋巢菌屬非洲黑蛋巢菌的營養液中存在顯著抑菌作用的生物活性物質，是一種具有二萜骨架鳥巢烷型碳架的二萜類物質，而猴頭菌素是典型的一類擁有二萜骨架鳥巢烷型碳架類型的二萜類物質，可促進神經生長因子（nerve growth factor，NGF）的合成。目前可從猴頭菌菌絲體中分離出15種猴頭菌素（猴頭菌素A～K，P～S），其中8種具有不同的神經保護特性，如增強NGF釋放（猴頭菌素A～I），減少β-淀粉樣蛋白沉積等。然而，目前還沒有直接證據表明這些化合物可以通過血腦屏障[35]，Er A是唯一一種專門用于將體外研究結果與體內研究結果相關聯的化合物[36]。LEE K F等[48]研究發現，在缺血性腦損傷后，Er A通過發揮活性氧清除劑的作用抑制p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和CCAAT增強子結合蛋白（enhancer binding protein，EBP）同源蛋白活化，保護神經元免受缺血損傷而死亡，具有神經保護和清除自由基的能力。Er C在星形膠質細胞中具有有效的神經營養因子誘導特性。RASCHERM等[49]研究發現，Er C誘導的神經營養活性通過原肌球蛋白受體激酶A（tropomyosin receptor kinase A，TrkA）受體及其相關的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）、磷脂酰肌醇-2激酶（phosphatidylinositide 2-kinases，PI2K）途徑和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑介導人前列腺癌細胞分化，同時能誘導ETS轉錄因子轉化特異性共識轉錄，獨立于神經營養蛋白的誘導，這一發現有助于解釋猴頭菌素類化合物的多效性功能。喬莉[38]研究表明，猴頭菌素S（erinacine S，Er S）可誘導胃癌細胞中活性氧積累導致細胞凋亡，但在正常細胞中則不然。同時，在體內異種移植的小鼠模型也顯示出其對腫瘤生長的抑制作用，據免疫組學分析顯示，Er S可以顯著增加Fas受體和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）相關的凋亡誘導配體蛋白，從而降低胃癌異種移植小鼠中增殖細胞核抗原和細胞周期蛋白D1的水平。綜上，猴頭菌素作為二萜類化合物的代表性物質，在保護神經系統和抗腫瘤方面意義顯著，具有極高的研究價值和臨床意義。CHANG C H等[50]在500 L反應器中培養猴頭菌，在培養基中加入葡萄糖、酪蛋白胨、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl2、CuSO4·5H2O、ZnSO4、Mn（NO3）2、Ni（NO3）2，發現猴頭菌的生物量和Er A的產量分別達到16.8 g/L和（225±54）mg/L，均得到明顯提升。CHENG P Y等[51]對6種培養基質進行篩選，結果發現，玉米粒為最佳培養基質，此外，還發現在培養基中加入NaCl或ZnSO4可使Er A的產率顯著提高至120.97 mg/g和165.36 mg/g。Er A只存在于菌絲體中，因此需要對猴頭菌的發酵時間做到嚴格把控。WOLTERS N等[52]在糖蜜培養基上固體發酵猴頭菌，根據不同培養基組分對Er C產生的抑制作用進行修飾，在培養基中添加硫酸銨、碳酸鈣、葡萄糖以及燕麥片。并對氮源對Er C含量變化的影響進行探究，最后選擇酪蛋白作為最佳氮源進行固體發酵，結果顯示Er C含量達到2.73 g/L，比現有文獻提到的濃度高10倍以上。除此之外，根據多位學者[50-52]研究表明，在培養基中添加無機物或微量元素進行發酵有益于猴頭菌素含量的增加，因而，關于影響發酵后猴頭菌素含量的因素可從發酵時間和培養基添加物及添加物的多少等方向展開研究。

3 結論

猴頭菌作為名貴的藥食兩用真菌，因其極高的營養價值和藥理活性，受到廣大消費者的青睞，市場需求日益旺盛。猴頭菌經固體發酵可產生多種活性物質，其中以多糖類、黃酮類和二萜類化合物為主的生物活性物質有著極高的藥用價值和研究意義。猴頭多糖目前在臨床被廣泛應用于治療急慢性胃炎、萎縮性胃炎、消化不良等消化系統炎癥，此外，對消化系統腫瘤亦有良好療效。以猴頭菌素為主的二萜類化合物因其良好的神經保護作用和抗氧化活性被廣泛應用于研究神經系統疾病，如治療阿爾茨海默癥、帕金森等神經系統退行性病變。在固體發酵技術因其獨特的優越性也越來越受到行業的關注。

目前關于猴頭菌的開發利用面臨以下難題：猴頭菌固體發酵基質的選擇和發酵條件的優化；猴頭菌固體發酵與生物活性物質之間關系的研究尚不明確；猴頭菌素直接通過血腦屏障及對神經系統保護作用的藥理機制尚不明確等。因此，猴頭菌的開發利用受到嚴重限制，針對猴頭菌資源開發利用目前面臨的困境和難題，建議進一步探索和優化固體發酵技術，以便對猴頭菌進行更深層次的開發利用、開拓更為廣闊的市場以及積極投入臨床治療，為猴頭菌資源的開發利用打開新局面。