急性胰腺炎患者血清miR-181a-5p表達及與Th17/Treg免疫平衡的關系

張 瑜， 辛前有， 馮亞飛， 郭 偉

(1.山西省長治市北大醫療潞安醫院普通外科， 山西 長治 046200 2.長治醫學院附屬和濟醫院胃腸外科， 山西 長治 046011)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是常見的消化系統急癥，其病情進展迅速，極易引發全身炎癥反應綜合征，導致多器官功能障礙或衰竭，致殘致死率高[1]。近年來隨著人口老齡化進展和生活水平的提高，AP發病率呈逐年上升趨勢，盡管近年來針對AP的診治已取得較大進展，但AP特別是重癥AP仍未得到控制，預后仍然較差[2]。因此研究AP發生發展機制是目前研究熱點。炎癥級聯反應參與AP發生發展[3]。研究表明，輔助性T細胞17/調節性T細胞(T helper cell 17/T regulatory cell，Th17/Treg)免疫失衡在AP炎癥反應中發揮至關重要的作用[4]。近年越來越多研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)參與AP發生發展[5]。miR-181a-5p是新近發現的miRNA家族成員，有研究通過分析AP患者循環中miRNA表達譜發現，miR-181a-5p在AP患者血清中表達顯著下調[6]。然而關于miR-181a-5p在AP患者血清中的表達和功能尚不清楚，本研究就通過檢測AP患者血清miR-181a-5p表達，分析其與Th17/Treg免疫平衡的關系，以期為AP防治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2020年1月至2021年12月我院收治的110例AP患者為AP組，其中男62例，女48例；年齡27～74(46.65±5.88)歲；體質指數18.25～30.65(23.54±1.68)kg/m2；病因：膽源性54例、酒精性25例、高甘油三酯血癥性18例、病因不明13例。另選取同期58名體檢健康者為對照組，其中男30例，女28例；年齡24～71(45.87±5.17)歲；體質指數18.77～26.32(22.87±1.18)kg/m2；兩組一般資料比較無差異(P>0.05)。納入標準：①AP符合《急性胰腺炎基層診療指南(實踐版·2019)》[7]診斷標準；②發病至入院時間<48h；③年齡≥18歲；④患者或家屬知情并簽署同意書。排除標準：①慢性胰腺炎急性發作、外傷性胰腺炎；②妊娠及哺乳期婦女；③合并嚴重心肝腎和造血系統、免疫系統損害、惡性腫瘤；④近3個月內使用免疫抑制劑和激素。本研究經符合赫爾辛基宣言。

1.2方 法

1.2.1外周血Th17、Treg和相關因子檢測 收集AP組入院次日清晨和對照組體檢時4mL外周靜脈血，分置2管(各2mL)，其中1管3000r/min離心15min(半徑10cm)后取上層血清，采用酶聯免疫吸附法檢測Th17相關因子[白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-17]和Treg相關因子[IL-10、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)]，試劑盒均購自武漢巴菲爾生物技術服務有限公司(編號：E-EL-H0102c、E-EL-H0105c、E-EL-H0103c、E-EL-H0110c)。另1管肝素鈉抗凝后，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，于RPMI 1640培養基中調整密度為1×106個/mL。用佛波肉豆蔻醋酸、離子霉素、布雷菲德菌素A處理細胞后，于37℃黑暗環境中孵育5h，獲取刺激細胞重懸于PBS中，加入相應抗體后采用賽默飛Attune NxT流式細胞儀通過流式細胞術檢測Th17、Treg百分比，并計算Th17/Treg比值。

1.2.2血清miR-181a-5p表達檢測:收集AP組入院次日清晨和對照組體檢時3mL靜脈血，3000r/min離心15min(半徑10cm)后取上層血清，Trizol法提取血清總RNA，反轉錄酶合成cDNA，以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒(上海赫果生物科技有限公司，編號：DRR820A)進行PCR擴增：miR-181a-5p正向引物：5′-AAGATGAGGGTGTTTACG-3′，反向引物：5′-AAGCCTTCTGCCTTAGTT-3′；miR-181a-5p內參U6正向引物：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，反向引物：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。反應條件：95℃ 90s，95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 15s，循環40次后收集Ct值，采用2-ΔΔCT法計算血清miR-181a-5p表達。

1.3AP嚴重程度分組:AP患者入院后48h參考《急性胰腺炎基層診療指南(實踐版·2019)》[7]評估AP嚴重程度，根據病情嚴重程度分為輕癥AP組(無并發癥和器官功能衰竭)41例、中度重癥AP組(有局部或全身并發癥，可伴有持續時間<48h的器官功能衰竭)37例、重癥AP組(伴有持續時間>48h的器官功能衰竭)32例。

2 結 果

2.1AP組與對照組miR-181a-5p、Th17、Treg比較:與對照組比較，AP組血清miR-181a-5p表達和外周血Treg百分比降低，Th17百分比和Th17/Treg升高(P<0.05)。見表1。

表1 AP組與對照組miR-181a-5p Th17 Treg比較

2.2AP組與對照組Th17、Treg相關因子表達水平比較:與對照組比較，AP組外周血IL-6、IL-17水平升高，IL-10、TGF-β1水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 AP組與對照組Th17 Treg相關因子表達水平比較

2.3不同嚴重程度AP患者血清miR-181a-5p表達和外周血Th17、Treg百分比比較:輕癥、中度重癥、重癥AP組血清miR-181a-5p表達和外周血Treg百分比依次降低，外周血Th17百分比和Th17/Treg依次升高(P<0.05)。見表3。

表3 不同嚴重程度AP患者血清miR-181a-5p表達和外周血Th17 Treg百分比比較[M(P25,P75)]

2.4不同嚴重程度AP患者Th17、Treg相關因子和Th17/Treg比較：輕癥、中度重癥、重癥AP組外周血IL-6、IL-17水平依次升高，IL-10、TGF-β1水平依次降低(P<0.05)。見表4。

表4 不同嚴重程度AP患者Th17 Treg相關因子和Th17/Treg比較

2.5AP患者血清miR-181a-5p表達與Th17/Treg的相關性 Pearson/Spearman相關性分析顯示，AP患者血清miR-181a-5p表達與IL-6、IL-17、Th17、Th17/Treg呈負相關，與IL-10、TGF-β1、Treg呈正相關(P<0.05)。見表5。

表5 AP患者血清miR-181a-5p表達與Th17/Treg的相關性

3 討 論

AP是多種病因引起胰腺分泌的胰酶在胰腺內異常激活，對胰腺和周圍器官產生消化作用而引起的以胰腺局部炎癥反應為主要特征的急腹癥，盡管臨床中80%～85%的AP為輕癥，但仍有20%的患者可發展為中度重癥甚至重癥，重癥AP常累及肺臟、肝臟、腎臟、心臟等全身多個器官，病死率高達30%～50%[8]。探索AP發生發展機制有助于早期診斷和提升治療效果。目前尚不完全明確AP發病機制，但胰腺腺泡細胞內炎癥信號通路的持續活化引起腺泡細胞結構破壞、凋亡和壞死在AP發病中扮演重要角色，而隨著病情進展炎癥又可累及全身多個器官，導致組織結構及功能損害[3]。

目前研究認為，Th17/Treg免疫失衡在AP發生發展中占據主導地位，二者均由Th0細胞分化而來，其中Th17細胞能通過分泌IL-6、IL-17等細胞因子放大炎癥，而Treg細胞能通過分泌IL-10、TGF-β1等細胞因子抑制Th17介導的炎癥，生理狀態下Th17細胞與Treg細胞數量恒定能維持Th17/Treg免疫平衡，當Th17/Treg免疫失衡則會促發炎癥反應，進而促進AP發生發展[9]。本研究結果顯示，AP患者外周血IL-6、IL-17、Th17百分比、Th17/Treg升高，而IL-10、TGF-β1、Treg百分比降低，說明AP患者Th0細胞明顯向Th17細胞分化，Th17/Treg免疫明顯失衡。同時結果顯示，AP患者外周血IL-6、IL-17、Th17百分比、Th17/Treg隨著病情加重而升高，IL-10、TGF-β1、Treg百分比隨著病情加重而降低，進一步說明Th17/Treg免疫失衡參與AP發生發展，符合既往研究報道[9]。 目前Th17/Treg免疫平衡成為了AP的研究熱點，但關于AP患者Th17/Treg免疫平衡相關的生物標志物報道較少。近年來隨著表觀遺傳學的深入，研究證實表觀遺傳學參與AP發生發展[10]。miRNA是一個新的表觀遺傳學中一類新的調控因子，能通過mRNA的3'-非翻譯區結合而降解或抑制其翻譯而調控基因表達，參與調節細胞增殖、分化、凋亡、炎癥等多種生物學功能，在AP發生發展中發揮重要作用。miR-181a-5p是一種高度保守miRNA，定位于人1號染色體前臂32.1處，近年研究發現miR-181a-5p是一個與炎癥反應高度相關的miRNA，如miR-181a-5p能靶向抑制高遷移率族蛋白B1緩解神經炎癥，能靶向抑制亮氨酸豐富重復FLII相互作用蛋白1抑制腎小球系膜細胞炎癥反應[11]。巨噬細胞M1極化是引發AP炎癥級聯反應的關鍵因素，有實驗發現，miR-181a-5p能靶向抑制高遷移率族蛋白B1抑制AP小鼠巨噬細胞M1極化[12]。這些發現支持我們推測miR-181a-5p參與AP的假設。本研究結果顯示，AP患者血清miR-181a-5p表達顯著降低，且隨著病情加重而降低，提示血清miR-181a-5p低表達可能參與AP發生發展，符合既往研究報道[6]。近期趙萌等[13]臨床研究報道，原發免疫性血小板減少癥患者外周血miR-181a-5p低表達與Th17/Treg免疫失衡有關。上述研究提示miR-181a-5p低表達與Th17/Treg免疫失衡密切相關，是否與AP中Th17/Treg免疫失衡有關？本研究結果顯示，AP患者血清miR-181a-5p表達與IL-6、IL-17、Th17、Th17/Treg呈負相關，與IL-10、TGF-β1、Treg呈正相關，提示miR-181a-5p低表達可能通過Th17/Treg免疫失衡參與AP發生發展。

綜上所述，AP患者血清miR-181a-5p表達降低、Th17/Treg免疫失衡，miR-181a-5p可能通過Th17/Treg免疫失衡參與AP發生發展。但本研究僅從血清方面研究了miR-181a-5p與AP患者Th17/Treg免疫平衡的關系，還需進一步實驗證實。