阿托品對形覺剝奪性近視模型大鼠的改善作用及作用機制

李錫謙， 康 平， 周 玉

(三六三醫院眼科, 四川 成都 611730)

近年來，近視的患病率迅速增加，特別是在東亞和東南亞地區，80%～90%的年輕人患有近視，20%左右的人患有高度近視[1]。高度近視增加眼部并發癥的風險，例如視網膜脫離、近視黃斑變性和脈絡膜血管新生，甚至導致視力喪失[2]。盡管近視已經非常普遍，但近視發展的機制仍不完全清楚。阿托品(atropine，ATR)是一種非選擇性可逆毒蕈堿拮抗劑，在臨床上常被用作睫狀肌麻痹劑、散瞳劑以及弱視治療劑[3]。最新研究發現ATR在減緩近視方面具有非常好的效果[4]，然而其作用機制尚不清楚。Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路通過調節細胞增殖、分化和遺傳穩定性來控制成熟組織的穩態，其異常或突變與人類的多種疾病有關，包括癌癥、骨質疏松癥、神經變性和心臟代謝疾病[5]。據報道，Wnt/β-catenin信號通路與近視的發生關系密切[6]。而ATR能否通過調控Wnt/β-catenin信號通路對形覺剝奪性近視大鼠起到一定的改善作用尚不明確。因此，本研究旨在探究ATR對形覺剝奪性近視大鼠的影響以及其作用機制。

1 材料與方法

1.1動物:60只SPF級雄性SD大鼠購自濱州醫學院，生產許可證號：SCXK(魯)2021-0005。本研究已獲得本院動物倫理委員會的批準。

1.2主要試劑:ATR購自江蘇悅興藥業有限公司；白細胞介素(interleukin，IL)-6(貨號：FY-A014251)、IL-1β(貨號：FY-A014118)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(貨號：FY-A014242)ELISA試劑盒購自上海富雨生物科技有限公司；Wnt/β-catenin通路激活劑TAK-715(貨號：S80610)購自上海源葉生物科技有限公司；Wnt(貨號：ab260036)、β-catenin(貨號：ab32572)、p-β-catenin(貨號：ab246504)、TGF-β1(貨號：ab215715)、TIMP-2(貨號：ab180630)、MMP-2(貨號：ab92536)、GAPDH兔多克隆抗體(貨號：ab9485)均購自英國Abcam公司。

1.3FDM大鼠模型構建及實驗分組:FDM大鼠模型參照文獻[6]構建。用膠水把遮光眼罩粘貼在大鼠右眼上，每天檢查眼罩是否脫落，若發現眼罩松動，及時用膠水貼好，左眼不做任何處理。NC組大鼠眼睛不做任何處理，共處理4周。將造模成功的48只SD大鼠隨機分為Model組、阿托品組(ATR組)、Wnt/β-catenin通路激活劑TAK-715組、ATR+TAK-715組，每組12只。ATR組按照3mg/kg的劑量右眼結膜下注射ATR[7]；TAK-715組按照10mg/kg的劑量右眼結膜下注射TAK-715[8]；ATR+TAK-715組在ATR組基礎上右眼結膜下注射10mg/kg TAK-715；NC組、Model組右眼結膜下注射等量的生理鹽水，每天一次，持續4周。

1.4標本采集:最后一次注射ATR后，測量大鼠右眼眼軸長度和屈光度，之后麻醉大鼠處死，收集血液，分離得到血清，置于-80℃保存備用。每組取6只大鼠的右眼鞏膜固定于4%多聚甲醛中，取剩余6只大鼠右眼鞏膜保存在-80℃冰箱。

1.5眼部生物學參數:采用手持帶光檢影鏡測定眼球相對屈光度，A型超聲儀測量眼軸長度，評估眼球屈光狀態變化。

1.6鞏膜形態比較:取鞏膜組織置于4%多聚甲醛溶液固定，脫水、包埋、切成5μm的石蠟切片，用蘇木精和伊紅(H&E)染色后在光學顯微鏡下觀察。

1.7血清炎癥因子水平:按照ELISA試劑盒說明書檢測血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.8RT-qPCR檢測鞏膜TGF-β1、MMP-2、TIMP-2 mRNA的表達:提取1.4保存的大鼠鞏膜組織總RNA，之后將總RNA反轉錄為cDNA，采用RT-qPCR測定轉化生長因子β1(TGF-β1)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質金屬蛋白酶抑制劑-2(TIMP-2)的mRNA表達量，反應條件為：預變性95℃/30s，40個循環(95℃/5s,60℃/30s)；以GAPDH為內參基因，引物使用NCBI在線設計，見表1。

表1 RT-qPCR的引物序列

1.9Western blot檢測鞏膜組織Wnt/β-catenin通路蛋白表達:取大鼠鞏膜組織勻漿，用RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，將蛋白質進行變性、定量、電泳、轉膜，封閉后分別加入一抗Wnt、β-catenin、p-β-catenin、TGF-β1、TIMP-2、MMP-2和GAPDH抗體(1∶1000)，4℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育2h，加入ECL試劑檢測蛋白質印跡。使用Image Lab軟件分析目標蛋白的灰度值。

2 結 果

2.1ATR對大鼠眼部生物學參數的影響:與NC組相比，Model組右眼眼軸長度和屈光度顯著增加(P<0.05)；與Model組相比，ATR組右眼眼軸長度和屈光度顯著降低(P<0.05)；TAK-715組右眼眼軸長度和屈光度顯著增加(P<0.05)；與ATR組相比，ATR+TAK-715組右眼眼軸長度和屈光度顯著增加(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠右眼生物學參數的比較

2.2ATR對大鼠鞏膜形態變化的影響:NC組大鼠鞏膜厚度正常，膠原纖維排列整齊，細胞外基質分布均勻；與NC組相比，Model組鞏膜變薄，膠原纖維排列稀疏紊亂；與Model組比較，ATR組鞏膜厚度增加，膠原纖維直徑增加；TAK-715組鞏膜破碎分離，纖維和細胞質基質之間的空隙增大；與ATR組相比，ATR+TAK-715組鞏膜厚度減小，纖維排列紊亂，見圖1。

圖1 各組大鼠鞏膜組織病理變化(HE，×200)

2.3ATR對大鼠血清炎性因子的影響:與NC組相比，Model組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與Model組相比，ATR組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，TAK-715組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與ATR組相比，ATR+TAK-715組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-1β IL-6和TNF-α水平的比較

2.4ATR對大鼠鞏膜組織TGF-β1、MMP-2、TIMP-2 mRNA表達的影響:與NC組比較，Model組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，MMP-2 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，ATR組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，MMP-2 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，TAK-715組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平顯著下降(P<0.05)，MMP-2 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與ATR組相比，ATR+TAK-715組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平顯著下降(P<0.05)，MMP-2 mRNA水平顯著升高(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠鞏膜組織中TGF-β1 MMP-2 TIMP-2 mRNA水平的比較

2.5ATR對大鼠鞏膜組織Wnt/β-catenin通路蛋白表達的影響:與NC組比較，Model組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Wnt、MMP-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，ATR組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平顯著升高(P<0.05)，Wnt、MMP-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，TAK-715組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Wnt、MMP-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與ATR組相比，ATR+TAK-715組大鼠鞏膜組織TGF-β1、TIMP-2、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Wnt、MMP-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見表5，圖2。

圖2 Western blot檢測鞏膜組織Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達

表5 各組大鼠鞏膜組織中Wnt/β-catenin通路相關蛋白水平的比較

3 討 論

近視已成為國際公共衛生問題，并給全球造成巨大的經濟負擔。近視可造成鞏膜組織丟失，I型膠原降解增加，以及視網膜萎縮和脈絡膜萎縮等變化[9]。本研究結果顯示，與NC組比較，Model組大鼠鞏膜變薄，膠原纖維排列稀疏紊亂，眼軸長度和屈光度顯著增加，表明形覺剝奪性近視大鼠模型構建成功。ATR是從植物顛茄、曼陀羅或莨菪等提出的生物堿，被證明在減緩近視進展方面始終有效[10]。研究[11]發現，0.01% ATR滴眼液可以使近視進展延遲，可能通過抑制鞏膜軟骨細胞中DNA和糖胺聚糖的合成實現。本研究中，ATR使鞏膜厚度增加，膠原纖維直徑增加，眼軸長度和屈光度顯著降低，與先前的研究一致，驗證了ATR對形覺剝奪性近視的改善作用。

眼軸增長為導致近視的重要原因之一，而鞏膜外細胞質基質重塑是眼軸增長的重要原因，許多研究表明MMP-2與TIMP-2之間平衡被破壞會導致細胞外基質重塑。TGF-β1可以通過上調TIMP-2表達或調節成纖維細胞與肌成纖維細胞之間的轉化，抑制細胞外基質的降解，MMP-2、TIMP-2以及TGF-β1可能是大鼠形覺剝奪性近視的關鍵調節因子[12]。另外，在近視眼網膜中，IL-6、TNF-α等炎癥因子上調，引發促炎級聯反應，從而導致眼部炎癥[13]。本研究結果顯示，Model組大鼠鞏膜中存在炎癥反應和胞外基質重塑，而ATR組IL-1β、IL-6、TNF-α水平和MMP-2 mRNA水平和蛋白水平顯著降低，TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平以及蛋白水平顯著升高，表明ATR可能通過減輕炎癥反應、抑制胞外基質重塑，對形覺剝奪性近視大鼠起到保護作用。

研究報道稱Wnt/β-catenin信號通路參與調控炎癥反應、纖維化和血管新生等生理病理過程，其異常或突變與近視密切相關，Wnt/β-catenin通路的活化通過調節鞏膜重塑，參與形覺剝奪性小鼠近視進展[14]，而Wnt信號通路拮抗劑DKK-1可減少屈光不正者的近視轉移[15]。本研究中，與Model組比較，ATR組大鼠Wnt蛋白水平顯著降低、p-β-catenin/β-catenin蛋白水平顯著升高，提示ATR可抑制形覺剝奪性近視大鼠鞏膜組織中Wnt/β-catenin信號通路的活化。為了驗證該推測，本研究利用Wnt/β-catenin信號通路激活劑干預發現，與ATR組相比，ATR+TAK-715組鞏膜損傷加重，IL-1β、IL-6、TNF-α水平、MMP-2 mRNA水平及MMP-2、Wnt蛋白水平顯著增加，TGF-β1、TIMP-2 mRNA水平顯著降低。表明TAK-715可減弱ATR對形覺剝奪性近視大鼠的保護作用，證實了ATR確實可能通過抑制Wnt/β-catenin通路，改善大鼠形覺剝奪性近視。

綜上所述，ATR可能通過抑制Wnt/β-catenin通路減輕炎癥反應，抑制胞外基質重塑，進而改善大鼠形覺剝奪性近視。然而，ATR調控大鼠形覺剝奪性近視可能涉及其他通路，有待深入探究。