miR-24-3p靶向BMP8B對成骨細胞功能影響的實驗研究

王建琪, 李召寶, 吳帥楠, 郭香君, 曹素敏, 林秀雅, 褚亞輝

(河北省滄州市中心醫院口腔科, 河北 滄州 061000)

牙周炎是由牙周袋內致病微生物引起的局部細菌感染性疾病，可造成牙齒支持組織的破壞，引起牙周附著喪失，嚴重時可發生牙齒的松動和掉落。其中人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)是牙周炎治療后牙周新附著形成的主要細胞來源，是牙周組織再生的基礎[1,2]。研究表明，牙骨缺損愈合的速度與成骨細胞的分化能力關系密切[3]。研究成骨細胞分化的分子機制對促進牙周組織再生有重要意義。Li等[4]研究顯示，抑制miR-24-3p表達可通過靶向上調SMAD家族成員5表達促進hPDLSCs成骨分化。骨形態發生蛋白8B(Bone morphogenetic protein8B，BMP8B)是轉錄生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族的成員之一，能夠參與機體原始生殖細胞的發育、骨組織再生等重要生理過程[5]。生物信息學預測顯示BMP8B可能是miR-24-3p的靶基因，但miR-24-3p是否通過調控BMP8B影響hPDLSCs成骨分化仍未有報道，因此本研究以hPDLSCs分離成骨細胞并探討二者對成骨細胞增殖、分化及凋亡的影響，為促進牙周組織再生提供新的分子靶標和一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1臨床標本、試劑與儀器:在2020年5月至2020年10月選取本院因正畸而拔除的20顆完整、無齲壞的前磨牙，患者年齡12～18歲，無基礎疾病、均簽署知情同意書。本研究經本院醫學倫理委員會審批并通過。DMEM培養基(A90113-500mL)；CCK-8試劑盒(FY600001-1ML)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(WK304)、堿性磷酸酶(application，ALP)活性檢測試劑盒(YT6469)、BCIP/NBT ALP顯色試劑盒(YT8174)、茜素紅染色液(YT8939)，北京伊塔生物公司；LipofectamineTM3000轉染試劑盒、蛋白提取試劑盒，美國艾美捷(武漢)公司(EF010-E、BC3711-50T)；BMP8B-siRNA序列，廈門慧嘉生物公司；反轉錄試劑盒、Trizol Reagent核酸分離試劑、AceQqPCR SYBR Green Mix、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司(RP1105-100T、YT526、ALH185、KFS303-HUV)；兔抗人BMP8B(bs-3670R)、Ⅰ型前膠原前肽(procollagenⅠCpropeptide，PICP)(mYF9825)、骨鈣素(又稱骨γ-羧基谷氨酸蛋白，Boneγ-Carbox- yglutamicacia-Containing protein，BGP)(YB-01221)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)(ATA34601)、β-actin(FT-B3350S)一抗、山羊抗兔HRP(SE12-0.1)二抗，武漢益普生物公司。二氧化碳細胞培養箱，美國ThermoFisher Scientific公司(型號BBD6220)；酶標儀、熒光定量PCR儀，美國Bio-rad公司(型號ELx800、C1000)；流式細胞儀，美國Beckman公司(型號CytoFLEX)。

1.2方 法

1.2.1hPDLSCs分離、培養及向成骨細胞誘導分化:①hPDLSCs分離及培養:將拔除的牙齒立即放入DMEM完全培養液中保存。依據參考文獻[4]通過無菌操作刮取出牙周膜組織并剪碎、以含10%青霉素的PBS液沖洗，制成hPDLSCs單細胞懸液，離心并接種至含10%滅活FBS+1%雙抗的DMEM中，在5%CO2培養箱中培養，溫度保持在37℃。②HDPSCs向成骨細胞誘導分化:取生長良好的第3代HDPSCs接種至6孔板(5×104/孔)，更換為成骨細胞誘導培養液(含10%FBS+50mg/L α-左旋抗壞血酸+10mmoL/L β甘油磷酸二鈉+0.1μmoL/L地塞米松+100U/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素的DMEM培養基)，換液/2d，繼續培養15d，采用堿性磷酸酶(application，ALP)染色及細胞礦化實驗鑒定為成骨細胞[4]。收集成骨細胞消化并接種至24孔板(2.5×105個/孔)，進行傳代培養。

1.2.2成骨細胞鑒定:取第4代成骨細胞繼續培養48h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。①ALP染色 取培養15d后的成骨細胞，消化并接種于室玻片上，根據BCIP/NBT ALP顯色試劑盒進行染色，操作嚴格按照試劑盒說明書進行，倒置顯微鏡下觀察并拍照。②茜素紅染色 取培養15d后的成骨細胞，加入300μL 0.4%的茜素紅S染液進行染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3細胞分組及轉染:重懸1.2.1對數生長期的成骨細胞，并將其接種于24孔板(2.5×105個/孔)。然后，將成骨細胞隨機分為4組(每組均6個復孔)，即空白對照組(正常培養成骨細胞不做特殊處理)；inhibitor-NC組(50 pmoL/μL inhibitor-NC)；miR-24-3p-inhibitor組(50 pmoL/μL miR-24-3p-inhibitor)；miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA組(50 pmoL/μL miR-24-3p-inhibitor及5μL BMP8B-siRNA)，以上質粒轉染均嚴格參照Lipofectamine TM3000的說明書進行，Lipofectamine TM3000的劑量為5μL。用含10%滅活FBS+DMEM完全培液繼續培養細胞48h。收集各組成骨細胞備用。

1.2.4實時定量聚合酶鏈反應:TRIzol法從1.2.3各組培養48h的成骨細胞中提取其總RNA，并測定濃度。按照PrimeScript RT reagent試劑盒的說明書將RNA逆轉錄合成cDNA。反應體系(20μL)包括：10μL ULtraSYBR mixture、2.0μL cDNA、2.0μL上游引物、2.0μL下游引物、4.0μL ddH2O。反應條件為：93℃預變性30s、93℃變性5s、65℃退火30s、延伸30s，循環40次。引物序列(泓迅生物，蘇州)詳見表1。采用2-ΔΔCt方法計算各組成骨細胞中miR-24-3p、BMP8B mRNA水平相對表達量。

表1 miR-24-3p BMP8B及內參引物序列

1.2.5CCK-8法:收集1.2.3培養48h的各組成骨細胞，調整密度至每孔2.5×105個細胞，接種在24孔細胞板上，24h后，加入CCK-8試劑，再培養2h，在490 nm處檢測各孔細胞光密度(optic density，OD)值，并以此為基礎計算增殖抑制率(%)，其計算公式為增殖抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD對照組)×100%。

1.2.6流式細胞術:取1.2.3各組培養48h的成骨細胞，制備成細胞懸液(1×106個/mL)。100μL細胞懸液中加入AnnexinV/PITC 5μL，20μg/mL的PI10μL，充分混勻，避光孵育30min(室溫)，流式細胞儀檢測成骨細胞凋亡率。

1.2.7ALP活性檢測:取1.2.3各組培養48h的成骨細胞，采用ALP活性檢測試劑盒檢測成骨細胞ALP活性，嚴格按照試劑盒說明書操作，以全自動酶標儀測定各樣品520nm吸光度(Optical density，OD)值，在ALP標準曲線上讀取酶活性值。

1.2.8免疫印跡法:收集1.2.3培養48h的各組成骨細胞，提取總蛋白后進行濃度檢測，然后用等量蛋白進行SDS-PAGE(10%)，轉膜、封閉后，添加BMP8B一抗及PICP、BGP、OPN一抗(均1∶1000稀釋)，4℃孵育過夜，然后加入山羊抗兔二抗(HRP標記，1∶5000稀釋)孵育1h。化學顯色后進行成像。分析各孔蛋白條帶灰度值。

1.2.9雙熒光素酶報告基因實驗:TargetScan預測miR-24-3p與BMP8B的核苷酸結合位點，構建BMP8B野生型質粒(BMP8B-WT)和突變型質粒(BMP8B-MT)。使用Lipofectamine TM3000將上述質粒分別與miR-24-3p-inhibitor-NC、miR-24-3p-inhibitor共轉染于成骨細胞，48h后，以自動熒光素酶檢測儀測定海腎熒光素、螢火蟲熒光素的熒光強度，并計算相對熒光素酶活性。

2 結 果

2.1成骨細胞的鑒定:細胞呈現粘附生長，且呈現多種不規則形態，包括梭形、三角形或多角形等，突起較多，胞核位于細胞一側呈卵圓形，符合成骨細胞形態學特征(圖1a)。ALP染色結果顯示，細胞核呈藍色陽性反應，胞質及周圍有棕色顆粒(圖1b)。茜素紅染色結果顯示，細胞有較多深紅色鈣化結節形成(圖1c)。以上結果表明誘導分化的細胞為成骨細胞。

圖1 成骨細胞鑒定

2.2各組成骨細胞轉染效果比較:miR-24-3p-inhibitor組和inhibitor-NC組成骨細胞均可見較強綠色熒光。與空白對照組、inhibitor-NC組比較，miR-24-3p-inhibitor組成骨細胞miR-24-3p水平顯著降低(P<0.05)。詳見圖2及表2。

圖2 轉染效果比較

表2 各組成骨細胞miR-24-3p水平比較

2.3各組成骨細胞增殖情況比較:與空白對照組、inhibitor-NC組比較，miR-24-3p-inhibitor組成骨細胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)；與miR-24-3p-inhibitor組比較，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA組成骨細胞增殖抑制率顯著升高(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組成骨細胞增殖情況比較

2.4各組成骨細胞凋亡情況比較:與空白對照組、inhibitor-NC組比較，miR-24-3p-inhibitor組成骨細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與miR-24-3p-inhibitor組比較，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA組成骨細胞凋亡率顯著升高(P>0.05)。詳見圖3及表4。

圖3 各組成骨細胞凋亡情況比較

表4 各組成骨細胞凋亡情況比較

2.5各組成骨細胞ALP活性比較:與空白對照組、inhibitor-NC組比較，miR-24-3p-inhibitor組成骨細胞ALP活性顯著升高(P<0.05)；與miR-24-3p-inhibitor組比較，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA組成骨細胞ALP活性顯著降低(P>0.05)。詳見表5。

表5 各組成骨細胞ALP活性比較

2.6各組成骨細胞中功能活性相關蛋白表達比較:與inhibitor-NC組、空白對照組比較，miR-24-3p-inhibitor組成骨細胞功能活性相關蛋白PICP、BGP、OPN顯著升高(P<0.05)；與miR-24-3p-inhibitor組比較，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA組成骨細胞功能活性相關蛋白PICP、BGP、OPN顯著降低(P<0.05)。詳見圖4及表6。

圖4 各組成骨細胞功能活性相關蛋白表達比較

表6 各組成骨細胞功能活性相關蛋白表達比較

2.7miR-24-3p靶向調控BMP8B:Targetscan(http://www.targetscan.org/)預測顯示，miR-24-3p與BMP8B存在核苷酸結合位點，詳見圖5。成骨細胞中，miR-24-3p-inhibitor顯著升高了BMP8B-WT的熒光素酶活性(1.37±0.21)(P<0.05)，而不影響BMP8B-MUT的熒光素酶活性，詳見圖6。與空白對照組、miR-24-3p-inhibitor-NC組相比，miR-24-3p-inhibitor組BMP8B mRNA、蛋白表達明顯增高(P<0.05)；與miR-24-3p-inhibitor組比較，miR-24-3p-inhibitor+BMP8B-siRNA組BMP8B mRNA及其蛋白表達顯著降低(P<0.05)。詳見圖7及表7。

圖5 靶向關系

圖6 熒光素酶活性測定

圖7 各組成骨細胞BMP8B蛋白表達

表7 各組成骨細胞BMP8B mRNA及其蛋白表達情況

3 討 論

近年來miRNAs對成骨細胞分化調節的相關研究層出不窮[6,7]。miR-24-3p屬于miRNAs家族重要一員，Wu等[8]研究顯示，下調miR-24-3p表達能夠促進牙髓干細胞成骨分化。然而miR-24-3p對牙周炎和骨分化調控作用機制尚不明確。基于此本研究以hPDLSCs為研究對象并誘導分化成骨細胞，分析miR-24-3p對成骨細胞增殖、凋亡的影響，并探究可能的分子機制，為臨床治療牙周病提供新的靶點和思路。本研究對hPDLSCs成骨誘導后顯示，細胞呈成骨細胞形態，且多數細胞ALP呈陽性(藍色)染色、有紅色礦化結節產生，說明成骨細胞誘導成功。成骨細胞增殖分化及凋亡狀態異常是影響骨重塑的重要因素[8]。ALP是早期成骨標志因子，能夠促進成骨細胞成熟、鈣化，其活性是反映成骨細胞分化程度及功能狀態的良好指標[9]。PICP是成熟骨細胞合成并分泌的膠原基質蛋白，是骨基質的主要有機成分；BGP是一種特異性非膠原基質蛋白，也是成骨細胞分化成熟的一種特異性標志物；而成骨細胞分化成熟的晚期標志物OPN能夠促進成骨細胞增殖與分化[10,11]。本研究結果顯示，抑制miR-24-3p表達后成骨細胞增殖抑制率、凋亡率降低，ALP活性及PICP、BGP、OPN蛋白表達升高，與Wu等[8]研究結果一致，說明抑制miR-24-3p表達可能促進成骨細胞增殖分化并抑制細胞凋亡。

BMP8B是一種多功能的生長因子，屬于TGF-β超家族成員，能夠調控骨形成[12]。既往研究顯示，過表達BMP8B能夠促進骨髓間充質干細胞成骨分化[13]。本研究結果顯示，抑制miR-24-3p表達后成骨細胞BMP8B mRNA及其蛋白表達水平升高，提示抑制miR-24-3p表達可能上調BMP8B表達促進成骨細胞增殖分化并抑制凋亡。當在抑制miR-24-3p的基礎上沉默BMP8B表達后，成骨細胞增殖分化能力被抑制，凋亡能力被提高。更加說明抑制miR-24-3p表達促進成骨細胞增殖分化及抑制凋亡，可能是通過上調BMP8B表達實現的。Chen等[14]過表達miR-24能夠靶向下調TGF-β1表達抑制心肌纖維化進展。本研究經targetscan預測和雙熒光素酶報告實驗證實了miR-24-3p與BMP8B的靶向關系。以上結果說明抑制miR-24-3p表達可能通過靶向上調BMP8B表達促進成骨細胞增殖分化并抑制細胞凋亡。

綜上所述，下調miR-24-3p表達能促進成骨細胞增殖分化并抑制細胞凋亡，可能是通過靶向上調BMP8B表達實現的，可為治療牙周病提供新的思路。然而牙周病發病機制復雜，有關miR-24-3p靶向調控BMP8B參與成骨細胞生物學行為是否與其他通路有關，有待進一步深入闡述。