茶黃素調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路對膝骨關節炎大鼠的治療作用

郭文帆， 楊學鈺， 鄭雪君， 盧吉高， 楊 勇, 李會東

(河北省張家口市第二醫院運動醫學科， 河北 張家口 075000)

膝骨關節炎(Knee osteoarthritis，KOA)是一種慢性退行性關節疾病，是老齡化社會中導致老年人膝關節疼痛、功能下降和殘疾的常見原因。KOA的病理生理機制十分復雜，現階段已發現炎癥在KOA的發病機制中起關鍵作用，其有助于KOA疼痛的發生[1]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息調節因子1(SIRT1)通路在協助細胞存活抑制炎癥和細胞凋亡以及刺激抗氧化劑合成方面起著不可或缺的作用，此外，上調SIRT1表達可通過靶向抑制核因子-κB(NF-κB)乙酰化進而抑制促炎因子的表達[2]。已研究發現紅花黃可通過調節AMPK/SIRT1/NF-κB通路改善TNF-α 誘導的軟骨細胞炎癥[3]。茶黃素是紅茶發酵過程產生的一種多酚物質，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用[4]。并且已有研究發現茶黃素可以抑制原代小鼠軟骨細胞中由叔丁基過氧化氫 (TBHP) 引起的合成代謝和分解代謝失衡，并可通過Keap1/Nrf2/HO-1軸改善軟骨細胞凋亡和衰老水平，此外，口服茶黃素還可改善骨關節炎(OA)小鼠骨關節炎的發展[5]。但對于茶黃素對KOA的治療作用尚無有報道，本研究通過向大鼠右膝關節注射碘乙酸鈉(MIA)建立KOA大鼠模型，探討茶黃素對KOA大鼠的治療作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料:76只雄性SD大鼠，(200±20)g，購自北京華益健康藥物研究中心，許可證號：SYXK(京)2019-0035。 將動物飼養在溫度(22±2)℃、濕度(60-80)%和12h/12h明暗交替的房間內，自由飲食飲水。

1.2實驗試劑:茶黃素(B20140)購自上海源葉生物科技有限公司；塞來昔布膠囊(H20213717，0.2g)購自北大醫藥股份有限公司；AMPK抑制劑Compound C( HY-13418A)購自MCE公司；IL-1β(RA20422)、TNF-α(RA20035)和COMP(RA20863)ELISA試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；SOD(A001-3-2)和MDA(A003-1-2)試劑盒購自南京建成；抗體AMPKα(ab32047)、NF-κB p65(ab32536)、SIRT1(ab110304)、GAPDH(ab8245)和辣根過氧化物酶 (HRP) 偶聯的二抗(ab6721)購自英國abcam公司。p-NF-κB p65(PA5-118566)、p-AMPKα(PA5-104982)購自Theremo Fisher公司。

1.3造模與分組:76只大鼠取13只作為空白組，其余大鼠通過0.3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉后，于右膝關節注射50μL，濃度為0.01mg/μL的MIA，空白組注射等量的生理鹽水[6]。兩周后觀察大鼠行為學變化，并從空白組和造模大鼠中隨機抽取3只，HE染色觀察右側膝關節軟骨的病理變化，使用Mankin和lequesne MG評分確定造模成功與否，當Mankin 和lequesne MG評分顯著升高時，表示造模成功。Mankin 評分標準為：評分系統評估軟骨表面損傷(0～6分)、細胞性喪失(0～3分)、基質染色喪失(0～4分)、潮痕完整性喪失(0～1分)；lequesne MG評分標準見表1。將剩余造模成功的60只大鼠隨機分為6組：模型組、茶黃素低劑量組(20mg/kg)、茶黃素中劑量組(40mg/kg)、茶黃素高劑量組(80mg/kg)、塞來昔布組(陽性藥，18mg/kg(根據臨床有效劑量折算))、抑制劑組，每組10只。剩余10只為空白組。除空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水，茶黃素低、中、高劑量組以及塞來昔布組分別灌胃相應劑量的藥物。抑制劑組除給予80mg/kg茶黃素外需尾靜脈注射0.2mg/kg AMPK抑制劑Compound C(根據購買說明書給藥)，其余組尾靜脈注射等體積生理鹽水，每天給藥一次，連續給藥4周。給藥4周后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈取血，室溫靜置1h后離心收集血清，-20℃保存備用。取右側膝關節軟骨，表型觀察其病理改變，一半經多聚甲醛固定24h后使用10%乙二胺四乙酸脫鈣后脫水包埋。另一半放入-80℃中備用。

表1 lequesne MG評分

1.4大鼠機械疼痛閾值檢測:大鼠適應性喂養后1天記為第1天。大鼠機械疼痛閾值檢測在第15天(造模后1天)，第29天(給藥第14天)和第43天(給藥第28天)進行。大鼠在金屬籠中適應30min后使用不同彎曲力的細絲刺激大鼠右肢足底二、三跖骨處，出現縮足反應時記錄為陽性，當記錄為陰性時，呈對數遞增刺激力度。初始刺激力度為2.0g，刺激時間為 8s，每只大鼠連續刺激3次，間隔為30s。記錄產生陽性反應的最小刺激強度為機械疼痛閾值。

1.5測量大鼠關節寬度并觀察大鼠行為學變化:在第15天、29天和43天時使用游標卡尺測量大鼠膝關節寬度，評估關節腫脹程度，并觀察大鼠行為學變化，給藥結束后1天進行lequesne MG評分。

1.6蘇木精-伊紅 (HE) 染色觀察大鼠膝關節軟骨病理學變化:大鼠膝關節軟骨脫鈣后，脫水、石蠟包埋，之后進行HE染色，于光學顯微鏡下觀察病理變化，并進行Mankin 評分。

1.7ELISA法測定血清炎癥因子(IL-1β 、 TNF-α 和COMP):取各組大鼠血清，通過使用各自ELISA試劑盒檢測血清中IL-1β、TNF-α、COMP水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.8WST-1法和硫代巴比妥酸法分別檢測氧化應激標志物SOD和MDA水平:1.7剩余血清通過使用WST-1法和硫代巴比妥酸法分別檢測大鼠血清SOD和MDA水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.9Western Blot檢測蛋白表達:取大鼠膝關節軟骨提取總蛋白，BCA測定總蛋白濃度。使用SDS-PAGE分離目的蛋白，并轉移至PVDF膜上，經5%脫脂奶粉封閉后與一抗p-AMPKα、AMPKα、SIRT1、p-NF-κB p65、NF-κB p65和GAPDH在4℃下孵育過夜，后與二抗室溫孵育1h，加入ECL顯色觀察蛋白條帶，Image J軟件評估蛋白條帶灰度值。

2 結 果

2.1各組大鼠造模成功評判:與空白組相比，造模大鼠Mankin和lequesne MG評分顯著升高，HE染色顯示造模大鼠染色不均勻，細胞排列紊亂，表面粗糙，排列不均勻，軟骨細胞數量減少，潮痕不明顯，顯示造模成功，見表2。

表2 各組大鼠軟骨組織Mankin和lequesne MG評分

2.2各組大鼠疼痛閾值及關節寬度變化情況:與空白組相比，第15天時，模型組、茶黃素低、中、高劑量組、塞來昔布組和抑制劑組大鼠疼痛閾值顯著降低，關節寬度顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，第29天和第43天，茶黃素低、中、高劑量組以及塞來昔布組大鼠疼痛閾值顯著升高，關節寬度減少(P<0.05)；與茶黃素高劑量組相比，抑制劑組大鼠疼痛閾值顯著降低，關節寬度增加(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠疼痛閾值及關節寬度變化情況

2.3各組大鼠軟骨組織的病理形態學觀察:空白組大鼠軟骨結構完整，足底正常，各骨層HE染色清晰均勻，表面光滑無裂隙，軟骨細胞分布均勻，無聚集；模型組軟骨層較薄，大鼠足底腫脹，HE染色不均勻，細胞排列紊亂，表面粗糙，排列不均勻，軟骨細胞數量減少，潮痕不明顯；茶黃素低、中、高劑量組以及塞來昔布組大鼠足底腫脹較模型組明顯減輕，軟骨表面損傷輕微，染色更均勻，軟骨細胞可見；抑制劑組較茶黃素高劑量組軟骨細胞數量較少，表面較粗糙，染色不均勻。各組Mankin和lequesne MG評分顯示，與空白組相比，模型組Mankin和lequesne MG評分顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，茶黃素低、中、高劑量組以及塞來昔布組大鼠Mankin和lequesne MG評分顯著降低(P<0.05)，而抑制劑組Mankin和lequesne MG評分高于茶黃素高劑量組(P<0.05)，見圖1和表4。

圖1 各組大鼠HE染色病理觀察(×200)

表4 各組大鼠軟骨組織Mankin和lequesne MG評分

2.4各組大鼠血清IL-1β、TNF-α 、COMP、MDA、SOD水平:與空白組相比，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α 、COMP和MDA水平均顯著升高，SOD水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，茶黃素低、中、高劑量組和塞來昔布組IL-1β、TNF-α 、COMP和MDA水平均顯著降低，SOD水平顯著升高(P<0.05)；與茶黃素高劑量組相比，抑制劑組大鼠血清IL-1β、TNF-α 、COMP和MDA水平均顯著升高，SOD水平顯著降低(P<0.05)，見表5和表6。

表5 各組大鼠血清IL-1β TNF-α和COMP水平

表6 各組大鼠血清MDA和SOD水平

2.5各組大鼠p-AMPKα、AMPKα、SIRT1、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達情況:與空白組相比，模型組大鼠p-AMPKα/AMPKα、SIRT1表達水平均顯著降低，p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，茶黃素低、中、高劑量組和塞來昔布組p-AMPKα/AMPKα、SIRT1表達水平均顯著升高，p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著降低(P<0.05)；與茶黃素高劑量組相比，抑制劑組p-AMPKα/AMPKα、SIRT1表達水平均顯著降低，p-NF-κB p65/NF-κB p65水平顯著升高(P<0.05)，見圖2和表7。

表7 各組大鼠p-AMPKα AMPKα SIRT1 p-NF-κB p65 NF-κB p65蛋白表達

圖2 各組大鼠p-AMPKα、AMPKα、SIRT1、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達注：A：空白組；B：模型組；C：茶黃素低劑量組；D：茶黃素中劑量組；E：茶黃素高劑量組；F：塞來昔布組；G：抑制劑組

3 討 論

KOA的主要病理是關節軟骨、軟骨下骨和關節部位軟組織中不可逆的退行性改變。本研究通過將MIA注射到大鼠膝關節誘導大鼠KOA模型，該模型與人類骨關節炎相關的疼痛和生化/結構變化最為相似[6]。向大鼠膝關節注射MIA兩周后，大鼠膝關節HE染色不均勻，細胞排列紊亂，表面粗糙，排列不均勻，軟骨細胞數量減少，潮痕不明顯，且Mankin和lequesne MG評分顯著升高，顯示造模成功。COMP的濃度已被證明是關節炎早期軟骨病變的候選指標[7]。此外，認為減輕氧化應激能有效改善KOA癥狀，已報道，SOD水平與KOA疾病嚴重程度呈負相關，而MDA水平與疾病嚴重程度呈正相關[8]。本研究探討了茶黃素對KOA大鼠的治療作用。結果表明茶黃素低、中、高劑量組可顯著升高KOA大鼠疼痛閾值和SOD水平，減小大鼠關節寬度，降低Mankin和lequesne MG評分COMP和MDA水平，另外還可改善KOA大鼠足底腫脹，使HE染色更均勻，軟骨細胞增多，表面損傷減輕。表明茶黃素可以改善KOA大鼠的關節疼痛并對KOA大鼠具有治療作用。

AMPK是一種廣泛表達且高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被稱為細胞能量傳感器，能夠抑制氧化應激和炎癥[9]。AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路在炎癥發生過程中其重要作用，SIRT1的激活依賴于AMPK，AMPK上調SIRT1的蛋白表達，并在病理條件下抑制炎癥，此外，SIRT1也通過抑制其下游靶點NF-κB進而減少促炎細胞因子(例如，IL-1β和TNF-α)的分泌，在抗炎中發揮作用。由于炎癥因子在KOA軟骨的破壞性改變和對軟骨骨結構變化的修飾中起重要作用，并會加重疼痛反應，因此，減少促炎細胞因子的產生(IL-1β和TNF-α)是治療KOA最重要的目標[10]。另外，已有研究發現兒茶素可通過AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路抑制TNF-α誘導的3T3-L1脂肪細胞促炎細胞因子(IL-1α，IL-1β，IL-6)的產生而減弱炎癥的發生[11]。本研究結果發現茶黃素可以增加AMPKα磷酸化、SIRT1表達水平，降低IL-1β、TNF-α的分泌以及NF-κB p65蛋白磷酸化水平，提示茶黃素可通過AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路抑制KOA大鼠炎癥進而發揮對KOA大鼠的治療作用。隨后加入AMPK抑制劑Compound C經驗證，發現抑制劑組可減弱茶黃素對KOA大鼠的治療作用，因此證實，茶黃素通過調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路對KOA大鼠起治療作用。

綜上所述，茶黃素對KOA大鼠具有明顯的治療作用，其通過激活AMPK和SIRT1蛋白水平，抑制NF-κB水平，減輕炎癥和氧化應激反應。證明AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路可作為治療KOA的新靶標，但其具體作用機制還需進一步深入研究。