基于網絡藥理學與分子對接的蒲公英抗乳腺癌的機制研究*

袁鑫怡，曾淑欣，楊潤，李羿

（成都醫學院藥學院，成都 610500）

中國每年女性乳腺癌發病率約7.7%，且病死率達8.12例/10萬[1]，目前已位列女性癌癥發病率首位。乳腺癌受多基因多靶點控制，發病機制復雜且不明確，晚期可出現多器官病變，威脅患者的生命。乳腺癌的治療手段多以放化療和根治性手術治療為主[2]，治療效果佳，但并發癥較多，且現有的治療乳腺癌的藥物毒副作用大，容易產生耐受性。因此，亟待尋找新的乳腺癌治療藥物。

蒲公英為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.Mazz、堿地蒲公英Taraxracum borealisinense Kitam或同屬數種植物的干燥全草，含有黃酮類、多糖、萜類、酚類[3]等多種活性成分?，F代研究表明，蒲公英黃酮通過調節基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、基質金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）-1及TIMP-2的表達來抑制乳腺癌MCF-7細胞的遷移和侵襲能力[4]；蒲公英多糖通過促進P53和Bax蛋白表達、抑制B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）蛋白表達來誘導乳腺癌細胞凋亡，抑制其增殖[5]；蒲公英萜醇能夠顯著抑制T47D乳腺癌細胞增殖、遷移并可誘導其凋亡[6]。但這些研究多聚焦于單一或指標成分，而蒲公英抗乳腺癌的分子機制尚不明確，有待進一步深入研究。本研究擬利用網絡藥理學整體性、系統性與中藥多成分、多靶點一致性的特點，預測蒲公英抗乳腺癌作用可能的作用靶點和作用通路，結合分子對接法驗證其結果的可靠性，為蒲公英臨床深入研究和資源開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 蒲公英活性成分和靶點的收集 在Batman-TCM 數據庫（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）里以“TARAXACUM MONGOLICUM”為檢索詞，以“Scorecutoff＞20，AdjustedP-value＜0.05”為條件，獲取蒲公英有效成分及其作用靶點信息，在TCMID數據庫（http：//47.100.169.139/tcmid/search/）以“PU GONG YING”為檢索詞篩選有效成分，在TCMSP數據庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）以“OB（%）≥30，DL（%）≥0.18”為條件獲取 TCMID 數據庫中符合條件的蒲公英有效成分及其作用靶點信息。以CancerHSP 數據庫（https：//old.tcmsp-e.com/CancerHSP.php）中的蒲公英有效成分及其靶點作為補充，檢索詞為“蒲公英”。

1.2 “有效成分-作用靶點”網絡的構建 將1.1中得到的蒲公英有效成分和作用靶點導入Cytoscape軟件，構建“有效成分-作用靶點”網絡。

1.3 乳腺癌靶點的收集及藥物-疾病靶點的獲取在 GeneCards 數 據 庫（https：//www.genecards.org/Search/Keyword?queryString=Breast%20Carcinoma）、OMIM 數據庫（https：//omim.org/）、TTD 數據庫（db.idrblab.net/ttd/） 和 DisGeNET 數據庫（https：//www.disgenet.org/home/）中以“Breast Carcinoma”為檢索詞收集乳腺癌相關靶點信息。在Malacards數據庫（https：//www.malacards.org）以“Breast Cancer”為檢索詞收集。在 Pharmgkb數據庫（https：//www.pharmgkb.org）里沒有“Breast Carcinoma”和“Breast Cancer”的信息，因此以“Carcinoma，ductal，breast”為檢索詞收集乳腺癌相關靶點信息。蒲公英有效成分作用靶點與乳腺癌疾病靶點通過venny2.1.1在線數據 庫（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）取交集，得到蒲公英抗乳腺癌的相關基因。

1.4 蛋白互作網絡（PPI）的構建 將1.3獲得的交集靶點基因導入String數據庫，物種選擇“Homosapiens”，參數Interactionscore設定為0.40，保存結果并對原始數據進行處理，分別建立network文件和type文件。將network文件和type文件信息依次導入Cytoscape3.8.0軟件繪制蛋白相互作用網絡并進行參數設置和調整，運用CentiScaPe2.2計算得到Degree值、Betweenness值和Closeness值，在Excel中以“Degree＞8.05，BetweennessunDir＞40.00，ClosenessunDir＞0.01”為條件篩選關鍵靶點，最終獲得蛋白-蛋白相互作用網絡和核心靶點網絡。

1.5 GO和KEGG通路富集分析 將1.4中得到的關鍵靶點導入DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）， 依 次 點 擊 “Official-Gene-Symbol”和“GeneList”，物種選擇“Homosapicns”。上傳數據后進行KEGG通路富集分析，并從生物學過程BP（biologicalprocess）、細胞組分 CC（cellularcomponent）、分子功能MF（molecularfunction）3個方面進行GO分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。將數據導出至Excel處理后導入微生信網站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）作圖得到 GO分析柱狀圖和KEGG通路分析氣泡圖。

1.6 分子對接驗證 將PPI網絡中度值排名靠前的靶點作為受體，以“有效成分-靶點”網絡圖中度值排名靠前的蒲公英活性成分作為配體，對兩者進行結合能力預測，結合能數值越低表明結合能力越好。在 uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）輸入關鍵靶點蛋白的基因名稱，查找得到靶點蛋白的uniprot號；在 RCSBPDB 數據庫（https：//www.rcsb.org/）中輸入靶點蛋白的uniprot號，找到相對應的靶點蛋白并下載其2D結構保存為pdb格式；導入pymol軟件進行去水和去配體操作，通過AntoDock軟件進行加氫處理并導出為pdbqt文件；通過PubChem下載蒲公英活性成分2D結構并保存為sdf格式，通過OpenBabel轉換為pdb格式文件，利用AntoDock軟件進行檢測扭轉鍵和中心等預處理并導出為pdbqt文件；將pdbqt格式的配體和受體文件導入AntoDock軟件，并采用半柔性對接方法進行對接預測分析，分析結果通過Pymol進行可視化處理。

2 結果

2.1 蒲公英活性成分及其靶點 在Batman-TCM數據庫里得到蒲公英14種成分，其中6種沒有靶點數據。在TCMSP數據庫中篩選了72種活性成分，只有5種活性成分符合條件，其中4種成分沒有目標信息，1種活性成分在CancerHSP數據庫進行篩選后得到。最后，總共獲得了10種活性成分，136個作用靶點，基本信息見表1。

表1 蒲公英活性成分及靶點Tab.1 Active ingredients and targets of dandelion

2.2 “有效成分-作用靶點”網絡的構建 “有效成分-作用靶點”圖如圖1所示，圖中黃色代表藥物，紅色橢圓形代表作用靶點，綠色長方形代表有效成分，邊代表成分與靶點之間的關系。

圖1 “有效成分-作用靶點”網絡圖Fig.1 Network diagram of“active ingredient-target of action”

2.3 乳腺癌靶點的收集及藥物-疾病靶點的獲取 利用GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET、Pharmgkb、Malacards數據庫篩選得到1 856個乳腺癌疾病靶點；最終通過韋恩數據庫2.1.1得到蒲公英抗乳腺癌的41個可能作用靶點，詳細信息見圖2，靶點蛋白信息見OSID。

圖2 蒲公英活性成分靶點與乳腺癌相關靶點的韋恩圖Fig.2 Wayne diagram of dandelion active ingredient target and breast cancer related target

2.4 蛋白互作網絡（PPI）的構建 將獲得的交集靶點基因導入String數據庫，通過Cytoscape3.8.0軟件對得到的數據進行可視化，繪制蛋白相互作用網絡及核心靶點網絡，見圖3和圖4。PPI網絡中包含40個節點和161條邊，顏色由深到淺表示節點的度值由大到小，節點由大到小表示節點的度值由大到小。經篩選得到重要的基因有ESR1、PPARG、PTGS2等。

圖3 PPI網絡Fig.3 PPI network

圖4 核心靶點網絡Fig.4 Core target network

2.5 GO和KEGG通路富集分析 利用DAVID6.8數據庫對2.4中得到的10個關鍵靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路分析，從BP、CC、MF 3個方面進行GO分析，共得到53條GO分析結果，按照P值大小進行GO分析柱狀圖的繪制，見圖5、圖6和圖7，柱越高代表涉及此過程的基因數目越多。其中P＜0.05的有47條GO分析結果，與BP有關的有RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始過程、類固醇激素介導的信號通路、應對雌二醇RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄正調控、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、前列腺形態發生中分支的調節等；與CC相關的有核染色質、核漿、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、蛋白質復合體、細胞器膜等；與MF相關的有DNA結合、轉錄調控區DNA結合、序列特異性DNA結合、酶結合、類固醇激素受體活性等。KEGG分析共得到12條KEGG通路，按照P值大小進行KEGG通路分析氣泡圖的繪制，氣泡顏色越深代表涉及此通路與疾病的相關性程度越高，見圖7。其中P＜0.05的有6條KEGG通路，即癌癥通路、含血清素的神經突觸、甲狀腺激素信號通路、癌癥中的蛋白多糖、癌癥中的微小RNA、甲狀腺癌，主要涉及的靶點有 AR、RXRA、CASP3、PRKCA、PPARG、PTGS2、CASP3、RXRA 和 ESR1。

圖5 GO-BP柱狀圖Fig.5 GO-BP histogram

圖6 GO-CC柱狀圖Fig.6 GO-CC histogram

圖7 GO-MF柱狀圖Fig.7 GO-MF histogram

2.6 分子對接驗證 本研究將PPI網絡中度值排名靠前的靶點PTGS2、PPARG、ESR1與“有效成分-靶點”網絡圖中度值排名靠前的蒲公英萜醇、蒲公英甾醇、七葉內酯進行結合能力預測，靶點蛋白作為受體，活性成分作為配體。一般認為，當受體與配體結合構象越穩定時，其能量越低，產生的相互作用型越大[7]。根據對接結果可知，除了Taraxerol和PTGS2的結合能大于零以外，其余成分和靶點的結合能都小于零，說明大部分成分和靶點都具有良好的結合活性。其中Taraxerol和ESR1的結合能最低，結合能力最好；Taraxasterol和PTGS2、PPARG、ESR1的結合能都較低，結合能力較好；Esculetin和PTGS2、PPARG、ESR1的結合能都較低，結合能力較好。上述成分與關鍵抗乳腺癌靶點最佳對接結構見圖8，全部對接結合能結果見表2。

圖8 KEGG氣泡圖Fig.8 KEGG bubble diagram

表2 分子對接結合能Tab.2 Molecular docking binding energy

3 討論

本研究通過網絡藥理學方法，構建蒲公英“成分-靶點”網絡，通過多個數據庫篩選到10種活性成分和137個作用靶點，其中與乳腺癌相關的靶點有41個，涉及ESR1、PPARG、PTGS2等10個關鍵靶點，揭示了蒲公英抗乳腺癌的物質基礎及分子機制。分子對接結果顯示，蒲公英與抗乳腺癌靶點結合能較低，說明其有良好的抗癌活性。

蒲公英發揮抗乳腺癌作用的有效成分可能是蒲公英萜醇、蒲公英甾醇和七葉內酯。研究表明，蒲公英萜醇通過誘導MCF-7細胞發生自噬，從而抑制細胞增殖，其機制可能與抑制mTOR信號通路有關[8]；蒲公英甾醇在腫瘤發展的多個階段均發揮了作用，包括抑制腫瘤發生、促進和誘導細胞分化，可以有效地抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移[9]；七葉內酯誘導涉及細胞凋亡的細胞毒性，其機制可能與降低線粒體膜電位、促進細胞色素c的釋放以及水解激活胱天蛋白酶-9/胱天蛋白酶-3的蛋白有關[10]。

為闡明蒲公英抗乳腺癌的機制，將PPI蛋白互作網絡中篩選得到的10個關鍵靶點通過GO功能富集分析，發現蒲公英抗乳腺癌的BP涉及激素代謝過程、炎癥反應的調節、轉錄過程和信號轉導等；CC主要涉及對核漿、核染色質、蛋白質復合體和RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物的調控；MF主要涉及DNA結合、酶結合、類固醇結合和轉錄因子活性等。GO富集分析發現蒲公英抗乳腺癌的主要靶點有AR、RXRA、PPARG和ESR1。AR作為介導雄激素生物學效應的細胞內受體，可以通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路參與乳腺的發育，同時能調節乳腺癌細胞的增殖[11]；RXRA是配體依賴的核受體家族的重要成員，在炎癥反應和代謝障礙中發揮重要作用，而乳腺癌特別是三陰型乳腺癌的發生發展始終伴隨著炎癥反應[12]；PPARG可調節糖脂代謝、細胞分化、腫瘤細胞凋亡、炎癥、肥胖等[13]，研究發現PPARG激活可減弱腫瘤細胞的遷移和侵襲，誘導腫瘤細胞凋亡[14]，PPARG作為抑癌基因在乳腺癌的腫瘤發生上起著關鍵作用，并且與乳腺癌患者總生存時間相關，研究表明PPARG可通過介導FABP4抑制乳腺癌的細胞生長、轉移及侵犯[15]；ESR1參與乳腺癌、子宮內膜癌和骨質疏松癥在內的病理過程，它參與調控基因轉錄信號通路及乳腺癌等婦科腫瘤細胞的增殖。

通過KEGG通路富集分析，發現蒲公英抗乳腺癌的通路主要是癌癥通路、癌癥中的微小RNA通路和甲狀腺激素信號通路等，涉及的主要靶點有CASP3、PRKCA和PTGS2。癌癥中的微小RNA可以在各類腫瘤和腫瘤組織異常表達，參與腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等[16]；甲狀腺激素可促進血管生成、抗細胞凋亡、抑制腫瘤細胞的生長和轉移[17]。CASP3編碼的蛋白質是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在腫瘤細胞凋亡的執行階段起著關鍵作用，通常被視作癌癥治療效果的標志物，研究發現腫瘤細胞利用凋亡過程產生有效的生長刺激信號，而活化的CASP3是細胞凋亡中的關鍵執行者，參與生長刺激[18]。PRKCA屬于絲氨酸和蘇氨酸特異性蛋白激酶家族，可能與腫瘤細胞過度增殖相關，它參與多種細胞信號傳導途徑，在許多不同的細胞過程中發揮作用，如細胞黏附、細胞轉化、細胞周期檢查點和細胞體積控制等；PTGS2是環氧合酶-2（COX-2）的編碼基因，而COX-2是誘導型酶，可參與炎癥反應、腫瘤細胞增殖和凋亡等多種病理過程[19]，PTGS2通過在乳腺癌中的過表達促進血管再生、腫瘤細胞的增殖和侵襲，從而促進腫瘤的發生、發展和轉移，Esculetin和PTGS2對接活性好，有效抑制了PTGS2的表達，可以預測為蒲公英治療乳腺癌的可能作用靶點。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學和分子對接法初步闡述了蒲公英抗乳腺癌的作用機制，通過對具有多成分、多靶點特點的蒲公英與乳腺癌復雜網絡關系的研究，闡述了蒲公英抗乳腺癌的有效成分、關鍵靶點、涉及的生物過程和通路，使“藥物-靶點”網絡可視化，為后續研究蒲公英抗乳腺癌提供了理論依據。

圖9 關鍵抗乳腺癌靶點和活性成分最佳對接圖Fig.9 Optimal docking diagram of key anti breast cancer targets and active ingredients