反式和順式二苯乙烯苷在大鼠體內的藥代動力學比較研究*

柴士偉，高建，厙立鶴，于俏，龐旭，韓立峰

（1．天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193；2．國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300193；3．天津市中藥化學與分析重點實驗室，天津 301617）

何首烏為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb．）的干燥塊根，味苦，歸肝、心和腎經[1]?，F代研究表明，2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷，TSG）是何首烏的主要活性成分[2]，中國藥典在2000年將其作為何首烏的定量指標，一直沿用至今[3]?，F代藥理研究發現：該化合物具有抗炎[4-5]、抗衰老[6]、抗氧化[7]、抗動脈粥樣硬化[8]、保肝[9-10]和抗腫瘤[11]等多種生物活性。由結構可知，TSG具有反式和順式兩種構型[12]，反式二苯乙烯苷（trans-TSG）可以在光異構的作用下轉變為順式二苯乙烯苷（cis-TSG）。有文獻報道cis-TSG可能是何首烏造成肝損傷的潛在毒性成分[13]，而trans-TSG目前為止未見任何肝毒性報道。由于trans-/cis-TSG的結構可以相互轉變，而體內安全性差異顯著，因此它們是否會表現出不同的體內藥代動力學行為，值得進一步研究。前期已有文獻報道trans-/cis-TSG的藥代動力學參數，但主要是以中藥制劑和提取物為主[14-15]，而這些制劑中的其他成分可能會對trans-/cis-TSG的體內藥代動力學行為產生影響。因此，本實驗以trans-/cis-TSG單體化合物為研究對象，建立了超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）分析方法，考察了單次給藥后，trans-/cis-TSG在大鼠體內的藥代動力學行為，為后續何首烏致肝損傷物質基礎及作用機制研究提供參考依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 12只雄性SD大鼠（200±20）g，購自北京維通利華生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號為SCXK（京）2016-0011，實驗已通過天津中醫藥大學倫理委員會批準，倫理審批編號為TCM-LAEC2021151。

1.2 藥品與試劑 trans-TSG（純度，HPLC面積歸一化法：99．13%），cis-TSG（純度，HPLC 面積歸一化法：100%）為實驗室自制，虎杖苷（上海源葉生物科技有限公司，ZM0530LA14，HPLC≥98%）。色譜乙腈、色譜甲醇（Thermo Fisher Scientific，美國），色譜甲酸（Anaqua Chemicals Supply，美國）。

1.3 儀器 Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜系統和Xevo TQ-S質譜系統聯用儀（Waters，美國）；KQ-1000DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XW-80A型渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠）；微量移液器（Eppendorf，德國）；Centrifuge冷凍臺式高速離心機（Eppendorf，德國）；BP121S型天平（Sartorius，德國）；Millipore純水器（Millipore，美國）。

2 實驗方法

2.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18Column（2．1 mm×50 mm，1．7 μm，Waters，美國）。乙腈（A）和 0．1%甲酸水（B）作為流動相，梯度洗脫，0～8 min，5%～45%B。柱溫設置為30℃，進樣體積為3 μL，流速為 0．3 mL/min。

2.2 質譜條件 負離子模式下，儀器方法的毛細管電壓、錐孔電壓和去溶劑化溫度分別設置為2．5 kV，30 V和650℃；氮氣作為去溶劑氣體，流速設置為800 L/h；多反應監測（MRM）模式和其他關鍵參數設置如表1所示，基于Masslynx 4．1和TargetLynx軟件，同時采集和分析大鼠血漿中trans-TSG和cis-TSG的定量信息。

表1 目標化合物的MRM參數Tab.1 MRM parameters of the target compounds

2.3 動物分組和給藥 12只大鼠隨機分為兩組，trans-TSG組和cis-TSG組，每組6只。嚴格按照天津中醫藥大學動物中心管理規范飼養，在室溫（20±5）℃，相對濕度55%～65%，通風良好，環境安靜，定期消毒的環境下適應性飼養一周，期間自由飲水和飲食。分別單次給藥60 mg/kg的trans-TSG和cis-TSG[16]，在給藥后按照時間點：0，0．033，0．083，0．17，0．25，0．33，0．5，1，2，4，8，10，24 h，眼眶內眥取血，取至預先加入 10 μL肝素鈉（100單位）的 1．5 mL離心管中，4 ℃離心 10 min（6 600×g），取上層血漿于-80℃冰箱冷凍保存。

2.4 血漿樣本的處理 取出-80℃冰箱冷凍保存的大鼠血漿樣品各100 μL，于4℃環境下解凍，分別加入600 μL冰甲醇和10 μL的內標溶液，渦旋震蕩5 min，4 ℃下離心 20 min（13 200×g），取出上清，氮吹干。加入100 μL 50%的甲醇水溶液復溶，渦旋震蕩 5 min，4 ℃下離心 20 min（13 200×g），取出上清，待測。

2.5 對照品溶液的配制 精確稱量trans-TSG、cis-TSG和虎杖苷（內標）各1 mg分別溶解于1 mL的甲醇溶液中得1 mg/mL的溶液，然后用甲醇分別進行稀釋得10 μg/mL的trans-TSG、cis-TSG和虎杖苷儲備液。

2.6 統計學方法 trans-TSG、cis-TSG的藥代動力學參數使用DAS藥代動力學軟件（版本1．0，中國藥理學會，中國）進行計算。將數據導入graphpad prism 8．0進行分析，計算結果使用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關分析采用線性相關與回歸分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2.7 方法學考察

2.7.1 專屬性 按照“1．2．4血漿樣本的處理”項下的實驗方法對空白血漿（A）、空白血漿加入對照品溶液及內標溶液（B）和血漿樣品加入內標溶液（C）進行分析。分別得到空白血漿色譜圖、血漿對照品色譜圖和血漿樣品色譜圖。

2.7.2 線性關系 精密吸取適量濃度為10 μg/mL的trans-TSG、cis-TSG儲備液，加入適量甲醇，cis-TSG 分別稀釋為 3．90，7．81，15．62，31．25，62．5，125，250，500，1 000和2 000 ng/mL一系列對照品溶液；trans-TSG 稀釋濃度為 1．95，3．90，7．81，15．62，31．25，62．5，125，250，500 和 1 000 ng/mL 一系列對照品溶液。分別吸取上述對照品溶液100 μL，氮氣吹干溶劑，加入 100 μL 空白血漿，按“1．2．4 血漿樣本的處理”項下操作，然后進樣分析?？v坐標表示標準品峰面積與內標峰峰面積比值，橫坐標表示標準品濃度，繪制回歸曲線，計算得線性回歸方程。

2.7.3 日內和日間精密度 各取空白血漿100 μL按照“1．2．4 血漿樣本的處理”項下的制備方法，配制“表3”中低、中、高3個濃度水平的混合標準品血漿樣品。日內精密度即測定低、中、高3個濃度水平的混合標準品血漿樣品，水平重復6次。日間精密度即連續3 d測定“日內精密度的樣品”，根據隨行標準曲線來確定濃度。計算相對標準偏差（RSD），并用測定濃度和已知濃度的百分比來評價準確度。

2.7.4 提取回收率和基質效應 配制低、中、高質量濃度的 trans-TSG（10、100和 1600 ng/mL）和 cis-TSG（5、50 和 800 ng/mL）的標準溶液，各取 100 μL，平行6份，分別加入10 μL內標溶液和100 μL空白血漿，樣品預處理后測定，所得峰面積結果記為A；另取同樣份數的空白血漿，加入10 μL內標溶液，經樣品前處理后測定，所得峰面積結果記為B；準備高、中、低3個濃度的標準溶液各100 μL，平行6份，分別加入10 μL內標溶液，氮吹干后，用100 μL 50%甲醇復溶，所得峰面積結果記為C。A/B×100%為提取回收率，A/C×100%為基質效應。

2.7.5 穩定性 按照“1.2.4血漿樣本的處理”項下制備方法，制備的低、中、高3個濃度水平的標準品血漿樣品，分別考察其穩定性。穩定性評價包括樣品盤內24 h穩定性、3次凍融循環穩定性。

3 結果

3.1 方法學驗證

3.1.1 專屬性 空白血漿色譜圖（A），血漿對照品色譜圖（B），血漿樣品色譜圖（C），如圖1所示，結果表明樣品色譜峰不受溶劑和內標的干擾，專屬性良好。

圖1 MRM模式下大鼠血漿中目標化合物的專屬性色譜圖Fig.1 Specificity chromatogram of the target compounds in rat plasma with the MRM mode

3.1.2 線性關系 目標分析化合物的線性回歸方程、相關系數和線性范圍如表2所示。結果表明，大鼠血漿中trans-TSG在3.90～2 000 ng/mL的范圍內線性關系良好，cis-TSG在1.95～1 000 ng/mL的范圍內線性關系良好。

表2 目標化合物的線性回歸方程、相關系數和線性范圍Tab.2 Linear regression equation，correlation coefficient and linear range of the target compounds

3.1.3 精密度和準確度 trans-TSG和cis-TSG的低、中、高3個濃度的日內精密度和日間精密度結果如表3所示，RSD值均小于12%，準確度在87.3～101.2，表明所建方法的精密度和準確度良好。

表3 目標化合物的精密度和準確度Tab.3 Precision and accuracy of the target compounds

3.1.4 提取回收率和基質效應 實驗結果如表4所示，trans-TSG低、中、高3個濃度的平均回收率分別為91.7%、94.1%和92.2%；cis-TSG的低、中、高3個濃度的平均回收率分別為97.1%、90.1%和95.3%。兩者的各個濃度的平均提取回收率均大于91%，且RSD均小于4.7%，表明trans-TSG和cis-TSG的回收率較高。

表4 提取回收率和基質效應Tab.4 Recovery and matrix effect

3.1.5 穩定性 trans-TSG和cis-TSG在樣品盤放置24 h后以及3次凍融循環之后進行處理的狀態下，低、中、高3個濃度的測定結果如圖表5所示，顯示出良好的穩定性。

表5 穩定性考察Tab.5 Study on the stability of the target compounds

3.2 血藥濃度-時間曲線 如圖2所示，大鼠單次灌胃60 mg/kg的trans-TSG和cis-TSG后，cis-TSG的血藥濃度高于trans-TSG。

圖2 trans-TSG和cis-TSG的血藥濃度-時間曲線Fig.2 Plasma concentration time curves of trans-TSG and cis-TSG

3.3 藥代動力學參數 trans-TSG和cis-TSG藥代動力學參數使用DAS藥代動力學軟件進行計算，符合一室模型，分析所得的藥-時曲線如圖2所示，藥代動力學參數如表6所示，單次給藥trans-TSG和cis-TSG 后，cis-TSG 在大鼠體內的 AUC0-t、AUC0-∞和Tmax均大于trans-TSG，但無統計學差異。cis-TSG在大鼠體內的半衰期（T1/2）顯著大于trans-TSG（P＜0．05）。而 trans-TSG 在大鼠體內的達峰濃度（Cmax）和清除率（CLz/F）則顯著高于 cis-TSG（P＜0．05）。

表6 大鼠單次灌胃trans-TSG和cis-TSG的藥代動力學參數（n=6）Tab.6 Pharmacokinetic parameters of trans-TSG and cis-TSG(n=6)

4 討論

具有順反結構的化合物，在一定條件下可以實現相互轉化。順反異構化過程及其機制，通常包括光異構化[17]、熱致異構化[18]和催化異構化[19]。而何首烏中trans-TSG向cis-TSG的轉化屬于光致異構化。一般來說，對于熱力學穩定的二苯乙烯類的反式結構，通過加熱條件是難以實現構型轉換，但在光照射下，反式異構體易轉變為順式異構體[20]。同時，二苯乙烯苷是多酚類化合物，意味著很容易發生氧化反應，因此二苯乙烯苷的降解除了可以通過光和熱的條件而引發之外，氧氣和堿性pH條件也應該格外注意[21]。因此，本研究在實驗操作過程中全程避光，所配制的溶液也存放在低溫避光環境，避免了trans-TSG和cis-TSG的相互轉化。同時，由于trans-TSG和cis-TSG的質譜碎裂方式相同，因此，在提取離子流色譜圖時，如果發生體內轉化，將會同時出現trans-/cis-TSG的色譜峰，但在本研究中，未發現有轉化現象（圖1C）。

單次灌胃給藥相同劑量的trans-TSG和cis-TSG后，cis-TSG在大鼠的AUC0-t大于trans-TSG，但未發現顯著性差異（P＞0．05）。trans-TSG 在大鼠體內的 Cmax和 CLz/F 均顯著高于 cis-TSG（P＜0．05），同時cis-TSG在大鼠體內的達峰時間（Tmax）和半衰期（T1/2）均大于trans-TSG，其中T1/2約為trans-TSG的4．4 倍，具有統計學差異（P＜0．05）。以上結果表明，cis-TSG在大鼠體內的暴露量高于trans-TSG，并且具有更低的清除率和較長的半衰期（P＜0．05），這表明cis-TSG在大鼠體內更容易出現蓄積，而有研究發現cis-TSG可能是何首烏中潛在的肝損傷風險成分[22]，這是否與cis-TSG在體內的蓄積有關，值得進一步的研究。

綜上所述，本研究建立了UPLC-MS/MS分析方法，研究比較了何首烏中trans-TSG和cis-TSG在大鼠體內的藥代動力學行為，為后續trans-/cis-TSG的進一步研究提供參考依據。