基于網絡藥理學和分子對接技術探討糖網明目顆粒治療糖尿病視網膜病變的作用機制*

王芳，王譽程，ODURO Patrick Kwabena，仝婉昱，冷玲，2，黎瑞巧，2，王啟隆，2，劉二偉，2

（1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617；2.組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

糖尿病視網膜病變（DR）作為糖尿病最常見的微血管病變之一，是造成糖尿病患者視力障礙的主要原因[1]。研究表明，炎癥和氧化應激可以促進非增殖性DR向增殖性DR的轉變[2-3]，血-視網膜屏障（BRB）完整性的破壞會加劇視網膜血管生成，進而損傷視力[4]。臨床常用的激光療法或者玻璃體內注射血管內皮生長因子（VEGF）抗體治療[5]具有成本高昂，不良反應多，治療時間長等局限性[6-7]。

中藥對糖尿病血管并發癥的保護作用受到越來越多關注，為DR的防治提供了新的途徑。糖網明目顆粒是基于治療DR的臨床經驗方——密蒙花方而開發的中藥6類新藥[8-9]。密蒙花方是在長期防治DR的臨床基礎上，在“心腎論治早期DR”的新思路指導下，以益氣養陰、交通心腎、和血明目為組方原則，用于防治非增殖期DR的經驗方。臨床研究表明該方對于早期DR患者，具有改善其全身及眼睛癥狀的功效，包括提高DR患者的視力、改變視疲勞、改善眼底血管狀態等，且證實了該方臨床長期用藥的安全性[10-11]。方中黃芪益氣健脾生血，烏梅收斂生津止血，兩者共為君藥以益氣養陰；黃連，肉桂能引火歸源，交通心腎，為臣藥；益母草、女貞子益肝腎明目、和血化瘀共為佐藥；密蒙花清熱瀉火、養肝明目，又可引藥上行，為使藥[9，12]。糖網明目顆粒利用現代工藝制藥，將以預防和早期治療為主要目的參與DR治療。

網絡藥理學是基于系統生物學理論，通過建立“藥物-靶點-疾病網絡”，從多角度分析藥物治療疾病的潛在機制[13]。分子對接技術通過模擬藥物分子和靶蛋白之間的潛在連接方式，預測藥物配體和蛋白質受體的對接模式和結合親和力，為中藥多成分、多靶點的藥物作用機制探索提供研究策略[14]。本文利用網絡藥理學和分子對接技術初步探討糖網明目顆粒治療DR的活性成分和作用機制并通過體外細胞實驗進行驗證，旨在為進一步研究糖網明目顆粒治療DR的機制以及臨床應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 糖網明目顆粒的化學成分以及靶標數據庫的構建 依據糖網明目顆粒所含的中藥，借助中藥系統藥理分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/）查詢化學成分，按照口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18的條件篩選具有活性成分的化合物，并結合文獻報道，補充含量較高、有藥理作用的活性成分納入表中。

通過 PharmMapper服務器（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/）對活性成分進行模擬分子-靶蛋白對接，構建活性成分靶點庫。將糖網明目顆粒化學成分的Mol2格式結構文件，上傳至PharmMapper服務器，以活性小分子為探針，搜尋潛在藥物靶點，進行虛擬篩選和預測化合物生物活性，得到活性成分的靶點預測結果，根據Norm Fit值由高到低排序，選擇前10個靶點作為活性成分的重要靶標，導入 UniProt數據庫（http：//www.uniprot.org/）中，限定物種為“人”，查詢對應的UniProtKB編碼和基因名稱。

1.2 DR靶基因數據庫的構建 在數據庫Disgenet（https：//www.disgenet.org/）和GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）中以“Diabetic retinopathy”作為關鍵詞構建疾病靶點庫。

1.3 靶點篩選 繪制維恩圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），對糖網明目顆粒的藥物靶點與DR靶基因數據庫進行匹配，選擇交集靶點作為糖網明目顆粒治療DR的潛在靶點。

1.4 蛋白互作網絡的構建與分析 使用STRING數據庫（https：//string-db.org/，version11.5），輸入潛在靶點，在organism項設置物種為“Homo sapiens”，隱藏單獨靶點得到蛋白互作網絡（PPI）。將PPI數據導入Cytoscape 3.6.0軟件中，利用MCODE功能篩選連接最為緊密的功能模塊。

1.5 中藥調控網絡的構建 將中藥、藥物有效成分、核心靶點文件導入Cytoscape 3.6.0軟件構建中藥-活性成分-核心靶點網絡圖。

1.6 基因富集分析和通路注釋研究 基因本體論（GO）是注釋基因及其表達產物的常用方法。使用R-4.1.1，導入作用靶點，引用“Stringr”“tidyr”“ggpubr”等程序包，設定閾值P≤0.05篩選具有顯著性差異的生物過程，并可視化GO富集分析結果。

京都基因與基因組百科全書（KEGG）可對藥物作用靶點或差異表達基因進行信號通路分析。將作用靶點導入 R-4.1.1，運用“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”等程序包進行KEGG通路富集分析，設定閾值P≤0.05篩選具有顯著性差異的可靠靶點通路。

1.7 分子對接 從RSCB PDB數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶點的3D結構保存為PDB格式文件，從TCMSP數據庫下載藥物活性成分的3D結構，保存為mol2格式。使用AutoDockTools 1.5.6軟件，以靶蛋白作為受體，將核心活性成分作為配體，根據靶蛋白復合物中配體的坐標確定活性位點，設置活性口袋，運行AutoDock Vina進行對接，用PyMol 2.2.0和Discovery Studio 2019進行結果分析。

1.8 體外實驗驗證

1.8.1 藥物 糖網明目顆粒，實驗使用該藥浸膏粉，3.5 g生藥/g，由北京紅太陽藥業有限公司提供，溶于無菌超純水中配制成300 mg/mL的母液。

1.8.2 細胞 人視網膜母細胞瘤細胞株Y79購自北納生物河南省工業微生物菌種工程技術研究中心（BNCC341293）。

1.8.3 試劑 RPMI-1640培養基，胎牛血清（FBS），青鏈霉素混合液購于美國Gibco公司；CCK8試劑盒，5×蛋白上樣緩沖液購于北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司；表皮生長因子受體（EGFR，貨號：0407-21）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）14（貨號：R1308-3）購于杭州華安生物技術有限公司；Tubulin（貨號：AC007）購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.8.4 儀器 CO2恒溫培養箱（HF240，力康生物醫療科技控股有限公司）、電泳儀（PowerPACTMHC，美國Bio-Rad公司）；Amershan Imager 600凝膠成像系統（日本GE公司）等。

1.8.5 細胞培養 Y79細胞在RPMI-1640培養基（10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液）中，于37℃、5%CO2的培養箱中培養。待培養瓶中細胞融合至80%～90%時，可進行傳代培養。

1.8.6 糖網明目顆粒的細胞毒性實驗 將Y79細胞以3×104個/孔的細胞密度，接種于96孔板中培養 12 h。加入不同濃度的糖網明目顆粒（0．2、0．4、0．8、1．0 mg/mL）干預 24 h。利用 CCK8 試劑盒測定細胞的生存率以探究糖網明目顆粒是否對該細胞具有毒性作用。

1.8.7 細胞分組及處理 細胞造模：在6孔板中均勻接種生長良好的Y79細胞，按5×105個/mL細胞密度加入2 mL完全培養基，每孔加入25 mmol/L高糖培養液培養12 h建立高糖損傷模型。細胞分組：正常對照組（NG組），高糖模型組（HG組），等滲對照組（DS組），0．4 mg/mL糖網明目顆粒干預高糖組（HG-TWMM G 組），0．2 mg/mL糖網明目顆粒干預高糖組（HG-TWMM L組）。去掉原高糖培養液，各組中加入含藥培養基或空白對照培養基，培養48 h。

1.8.8 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測細胞中EGFR和MAPK14蛋白表達 藥物干預48 h后，提取細胞蛋白并利用BCA試劑盒測定各樣品蛋白濃度，稀釋配平變性后進行Western blot實驗。細胞蛋白上樣量為10 μg/孔；電泳轉膜完成后封閉2 h，按照蛋白分子量裁取條帶，一抗孵育過夜。第2天洗膜進行二抗孵育1．5 h，洗膜。AI600凝膠成像系統曝光，統計條帶灰度值。目的蛋白相對表達量為蛋白灰度值/內參灰度值/正常組，采用SPSS 25．0統計軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析檢驗，P＜0．05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖網明目顆粒活性成分的篩選 糖網明目顆粒中包含的活性成分信息表見OSID碼。根據TCMSP數據庫獲取黃芪，黃連，密蒙花，女貞子，烏梅，益母草所含成分。由于肉桂中沒有符合OB≥30%，DL≥0．18的活性成分，通過查閱文獻補充肉桂中的有效成分（如：肉桂酸，異甘草素，醋酸桂皮酯等）[15-16]納入到活性成分表中，最終得到黃芪化學成分20個，黃連化學成分14個，密蒙花化學成分4個，女貞子化學成分13個，烏梅化學成分8個，益母草化學成分8個，肉桂化學成分5個。

2.2 靶點預測以及PPI網絡分析 將活性成分在PharmMapper中返回的前300個潛在作用靶點依據Norm Fit值由高到低排序，選擇前10個作為活性成分的重要靶標。在Uniprot數據庫的檢索功能中輸入靶標的PDB ID，限定物種為“人”，對應得到靶點的基因名稱，去除重復后得到271個靶點。將獲得的271個靶點與Disgenet及GeneCards數據庫中與DR相關的疾病靶標對比分析，交集歸納得到62個與糖網明目顆粒治療DR相關聯的潛在作用靶點，見圖1。

圖1 糖網明目顆粒-DR共同靶基因韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Tangwang Mingmu Granules-DR common target gene

將62個潛在作用靶點導入到STRING數據庫中，建立 PPI網絡。將 PPI網絡導入 Cytoscape 3．6．0軟件，得到56個相互作用的節點和297條邊。利用MCODE功能篩選出連接最為緊密的功能模塊（Score=12．333），得到19個核心靶點，111條邊（圖2）。核心靶點信息見表1。

圖2 作用靶點的PPI網絡構建Fig.2 PPI network construction of action target

表1 核心靶點信息Tab.1 Core target information

2.3 中藥-活性成分-核心靶點網絡的構建及分析使用Cytoscape 3．6．0軟件構建糖網明目顆粒活性成分-核心靶點的網絡模型，如圖3所示。圖中共產生87個節點，185條邊。不同顏色的節點分別代表中藥、活性成分、調節的核心靶點，邊代表活性成分和靶點間的相互作用。結果表明了糖網明目顆粒多成分、多靶點的協同作用模式。

圖3 中藥-活性成分-核心靶點網絡圖Fig.3 Network diagram of Chinese medicine，active ingredients and core targets

2.4 潛在靶點的GO生物功能注釋分析 GO生物功能注釋分為3個方面：生物過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF）。對62個潛在作用靶點進行GO富集分析，得到147條BP相關，31項CC相關，48條MF相關。將最顯著的前10條進行展示。見圖4。其中，糖網明目顆粒作用靶點在BP中的富集包括細胞過程、凋亡過程、蛋白代謝過程、RNA生物合成過程、化學反應、細胞蛋白修飾過程等主要生物過程，富集條目如：信號轉導（signal transduction），占總富集數目的18．03%；抗細胞凋亡（negative regulation of apoptotic process），占總富集數目的 14．75%；RNA聚合酶Ⅱ對轉錄的正調控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter），占總富集數目的14．75%。在CC中，富集條目分布于細胞質基質（cytosol）、細胞質（cytoplasm），分別各占據總富集數目的 49．18%與47．54%。MF 中，富集條目主要是蛋白質結合（protein binding），占總富集數目的78．68%。

圖4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

2.5 潛在靶點的KEGG通路富集分析 運用R語言，對糖網明目顆粒的潛在作用靶點進行KEGG通路分析，以P≤0．05為篩選條件，得到163條生物通路，取前20條生物通路進行可視化分析（圖5），涉及糖尿病并發癥中的晚期糖基化產物（AGE）-晚期糖基化終末產物受體（RAGE）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、內分泌抵抗、FoxO信號通路、白細胞介素-17（IL-17）信號通路等。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接分析 選取中藥-活性成分-核心靶點網絡中，度值＞5的靶點作為受體，每味藥中度值最高的活性成分作為配體，進行分子對接驗證，結合自由能如表3所示。普遍認為，Affinity＞-4 kcal/mol，結合力極弱或認為無結合；-7 kcal/mol＜Affinity≤-4 kcal/mol，結合力中等；Affinity≤-7 kcal/mol，結合力較強。選取每個靶點與活性成分結合自由能最低的對接結果用PyMol進行可視化分析圖見OSID碼。結果顯示靶點與活性成分之間均可以穩定結合，相互影響，表明糖網明目顆粒對DR多成分，多靶點的協同治療作用。

表3 分子對接結果Tab.3 Molecular docking results

2.7 糖網明目顆粒對Y79細胞高糖模型的影響

2.7.1 糖網明目顆粒的安全濃度篩選 糖網明目顆粒濃度在0．2～0．8 mg/mL范圍對Y79細胞沒有毒性。故選擇 0．2 mg/mL，0．4 mg/mL 為糖網明目顆粒的細胞給藥劑量。見圖6。

圖6 糖網明目顆粒對Y79細胞活力的影響（n=3）Fig.6 Impacts of Tangwang Mingmu Granules on the expression of EGFR and MAPK14 proteins(n=3)

2.7.2 糖網明目顆粒對Y79細胞中EGFR和MAPK14蛋白表達的影響 與NG組相比，HG組的EGFR、MAPK14 蛋白表達水平明顯增高（P＜0．05），但給藥組可顯著降低EGFR、MAPK14蛋白表達水平。見圖7。

圖7 糖網明目顆粒對EGFR和MAPK14蛋白表達的影響（n=3）Fig.7 Impacts of Tangwang Mingmu Granules on the expression of EGFR and MAPK14 proteins（n=3）

3 討論

糖網明目顆粒中黃柏酮，7-O-甲基異鼠李糖醇，金合歡素，木犀草素，表兒茶素，花生四烯酸甲酯，花生四烯酸與PPI核心靶點具有良好的結合能力，提示其可能是治療DR的關鍵成分。其中木犀草素可抑制VEGF誘導的血管生成，有助于抑制早產兒視網膜病變的發病[17-18]。表兒茶素顯著減少高糖誘導的人視網膜上皮細胞ARPE-19細胞活性氧的產生，并減少細胞凋亡和炎癥相關因素[19]。花生四烯酸的多種代謝產物被證實與DR期間的微血管功能障礙有關[20-21]；黃柏酮可以調節細胞的增殖和凋亡[22]等。

骨形態發生蛋白2（BMP2）是PPI網絡篩選出的核心靶點之一。研究表明，BMP2的水平在DR患者和DR小鼠視網膜中升高，破壞了內皮屏障功能，上調視網膜中VEGF水平，誘導內皮-白細胞黏附并上調炎癥標志物和細胞因子，如細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-8（IL-8）[23-24]。類固醇激素受體輔激活子（SRC）在細胞增殖，分化等細胞進程中發揮重要作用，可以直接與VE-鈣黏蛋白結合，從而調節VE-鈣黏蛋白酪氨酸磷酸化和內皮通透性[25]。纖維連接蛋白1（FN1）參與調節細胞黏附、遷移或腫瘤轉移等，研究表明，纖維連接蛋白在視網膜血管化活動區中上調，并可能參與DR中病理性血管的生成[26-27]。

GO富集分析結果表明，糖網明目顆粒治療DR機制主要涉及的關鍵生物過程包括凋亡過程的負調控，細胞增殖的正調控，RNA轉錄調控等，分子功能涉及蛋白質結合，受體結合，激酶活性等方面。KEGG富集分析說明，糖網明目顆粒的主要活性成分可能是通過介導AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、內分泌抵抗、FoxO信號通路、IL-17信號通路等途徑來治療DR。其中AGE-RAGE信號通路可激活蛋白激酶C（PKC）和MAPKs等多個細胞內信號通路，導致細胞核轉錄因子（NF-κB）激活，促進多種促炎細胞因子如白細胞介素-1（IL-1），IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達，可引起視網膜毛細血管細胞凋亡，血管通透性增加，破壞血-視網膜屏障，促進DR的發展[28-30]。研究顯示，AGEs可以通過RAGE/Src/ERK信號通路發揮血管生成作用，激活的SRC參與引起內皮細胞存活和血管生成刺激的信號通路，表明SRC可能是預防和治療AGEs相關微血管病變的合適靶點[31]。AGEs還可導致DR中的病理性血管生成，提示AGE是糖網明目顆粒治療DR的靶點[32]，此推測需要通過體內外研究進一步驗證。

分子對接結果表明，糖網明目顆粒中木犀草素、金合歡素等活性成分與EGFR、BMP2、MAPK1、MAPK14等靶點具有良好的結合作用，能夠與氨基酸形成較強的氫鍵相互作用。該結果進一步驗證了網絡藥理學篩選結果，表明糖網明目顆粒治療DR的主要作用機制在于木犀草素、金合歡素、表兒茶素等活性成分通過 EGFR、BMP2、MAPK1、MAPK14等靶點對腫瘤壞死因子、FoxO等信號通路進行調控，從而參與DR的治療過程。

上述結果在細胞模型中進行了驗證。高糖環境刺激Y79細胞可增加EGFR、MAPK14蛋白表達，而糖網明目顆粒有效抑制了EGFR和MAPK14蛋白表達。MAPK14是MAP激酶信號轉導途徑的重要組成部分，MAPK信號通路與TNF信號通路相關聯；EGFR則會激活下游的PI3激酶（PI3K）-絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）、轉錄活化因子（STATs）等模塊[33]，涉及到炎癥反應、細胞增殖與凋亡、氧化應激等。該結果進一步驗證了糖網明目顆粒治療DR的作用機制。但是，本研究僅通過數據挖掘對糖網明目顆粒治療DR的機制進行了預測以及簡單驗證，仍然存在局限性，尚需要進行基礎實驗深入研究。

4 結論

本研究通過網絡藥理學和分子對接的方法篩選糖網明目顆粒中的有效成分和治療DR的作用靶點，繼而以細胞實驗對所預測機制中的相關蛋白進行檢驗，結果表明糖網明目顆粒有效抑制了EGFR和MAPK14蛋白表達。推測糖網明目顆粒通過參與調節機體氧化應激，炎癥反應，細胞增殖和凋亡等生物過程，達到對DR的治療作用。本研究充分體現了糖網明目顆粒治療DR具有多成分，多靶點，多途徑協同發揮藥效的特點，為糖網明目顆粒對DR的治療及后續深入研發提供指導與依據。