基于胰腺PI3K/AKT/BMAL1通路探討針刺對2型糖尿病大鼠血糖晝夜節律的影響*

王栩，張月，劉漢東，李潔，趙文清，周瓊陽，張智龍

（1．天津市中醫藥研究院附屬醫院針灸科，天津 300120；2．天津市紅橋醫院中醫科，天津 300131；3．天津中醫藥大學研究生院，天津 301617）

糖尿病嚴重威脅著人類的健康，根據2019年國際糖尿病聯盟發布的數據顯示，至2045年將有1．472億人患有糖尿病[1]。在2020年美國糖尿病學會頒布糖尿病醫學診療標準中，新增了對2型糖尿病（T2DM）患者應用動態血糖譜報告評估血糖管理的推薦[2]，由此說明血糖晝夜節律的調節對T2DM的治療具有重要意義。血糖晝夜節律受胰島生物鐘節律的影響。目前，改善血糖晝夜節律的西藥主要包括胰高血糖素樣肽-1受體激動劑、磺脲類等，但上述藥物存在諸多不良反應，如低血糖、胃腸道反應、皮疹等，影響藥物的長期應用。血糖晝夜節律失衡而引起的持續高血糖可引起多種急慢性并發癥，嚴重影響了患者的生活質量。

研究認為，腦和肌肉芳香烴受體核轉位蛋白1（BMAL1）可調節胰島生物鐘的節律性，維持血糖晝夜節律[3]。其上游受磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）通路的調控，PI3K可磷酸化下游絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）的蘇氨酸 308位點（pAkt T308）而激活AKT[4]。而AKT又可進一步激活BMAL1，從而調節血糖晝夜節律[5]。同時，針灸對T2DM具有治療作用，1項系統評價表明單純針刺和針刺配合降糖藥均可降低T2DM患者空腹及餐后2 h血糖、糖化血紅蛋白，且療效優于假針刺及單純使用降糖藥[6]。筆者前期的臨床及機制研究顯示，調理脾胃針法可有效降低血糖；改善PI3K通路上下游關鍵蛋白表達及胰島結構[7-9]，但對PI3K/AKT/BMAL1介導針刺調節血糖晝夜節律的作用尚不明確。故本研究以高脂高糖結合小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的T2DM大鼠為針刺效應平臺，重點研究調理脾胃針法調節血糖晝夜節律失衡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠36只，體質量（120±20）g，5周齡。購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物許可證編號：SCXK（京）2019-0010。動物飼養于天津市中國醫學科學院放射醫學研究所，研究方案獲研究所倫理委員會批準（No．IRM-DWLL-2020132），實驗動物的處置符合2006年發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要試劑及儀器 STZ（S0130，Sigma公司），大鼠胰島素（INS）酶聯免疫吸附法（ELISA）Kit（CSB-E05070r，武漢華美生物公司），PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1 抗 體（ab183957，ab233755，ab38449，ab273648，英國Abcam公司），二抗（北京博奧森生物技術有限公司），ECLplus超敏發光液（PE0010，北京索萊寶公司），TUNEL試劑盒（Roche公司）；中研太和針灸針（0．3 mm×13 mm），血糖儀及試紙（越佳型至新，雅培公司），酶標儀（美國Bio-Tek公司），凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司），脫水機及包埋機（武漢俊杰電子有限公司），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司），熒光顯微鏡（OLYMPUS公司）。

1.3 模型建立 將大鼠適應性喂養1周后，采用高脂高糖飼料喂養2個月（高脂高糖飼料配方：蔗糖20%、豬油10%、蛋黃粉5%、膽固醇1%、豬膽汁酸鈉0．1%、普通飼料63．9%）。后將造模大鼠禁食12 h，并按體質量一次性快速腹腔注射STZ溶液（以 0．1 mol枸櫞酸鹽緩沖液配制，pH=4．6），并按注射體積10 mL/kg，注射劑量25 mg/kg，STZ濃度2．5 mg/mL注射，30 min內使用完。于注射完成72 h后采用尾靜脈取血方式，使用血糖儀測量血糖，以連續5 d隨機血糖＞16．7 mmol/L為T2DM造模成功[10]。動物成模后均予以普通飼料喂養。

1.4 動物分組及干預方法 采用隨機數字表法將36只大鼠隨機分為空白組10只與造模組26只，造模組按照上述造模方法造模，最終死亡6只，并將剩余的20只大鼠隨機分為針刺組10只，模型組10只。針刺組取穴為：曲池、合谷、血海、足三里、豐隆、陰陵泉、地機、三陰交、太沖（以上穴位均取雙側），中脘，具體穴位定位參照李忠仁主編的《實驗針灸學》[11]。具體操作：首先將大鼠置于自制大鼠針刺服中[8]，以減少躁動。身著大鼠針刺服后，大鼠躁動基本消失，可同時多針刺、久留針，并可多只同時針刺操作，具有針刺可行性。而后穴位與針具常規消毒，選用中研太和0．3 mm×13 mm針灸針進行針刺，并于 23：30、05：30、11：30、17：30 進行針刺，每次留針30 min，每日治療1次，每周治療5次，共治療4周。空白組及模型組不予干預。

1.5 檢測指標

1.5.1 一般情況 對造模前后大鼠的精神狀態、毛色、進食量、飲水量、尿量、便質進行觀察。

1.5.2 4時相即時血糖檢測 于干預前及針刺4周后，將各組大鼠禁食12 h，自由飲水。分別于0、6、12、18時采用尾靜脈取血法，用血糖儀測量即時血糖。

1.5.3 平均血糖的標準差（SDBG）和最大血糖波動幅度（LAGE）檢測 SDBG：先計算4時相血糖平均值，再將4時相血糖值與平均值之差的平方和除以6，最后將值開方。LAGE：最高血糖值與最低血糖值之差。

1.5.4 空腹血清胰島素（Fins）含量 于干預前及針刺4周后，將各組大鼠禁食12 h，自由飲水。于18時血糖檢測完畢后，采用眼眶靜脈取血法，取3 mL血液，然后將血液低溫離心，取上清液，采用ELISA檢測Fins。

1.5.5 胰腺熒光TUNEL染色 于針刺4周后，眼眶靜脈取血完畢后，將各組大鼠處死，分離胰腺并于冰生理鹽水中洗去血液至液體澄清。固定后將石蠟切片脫蠟，滴加破膜工作液覆蓋組織，孵育漂洗后，滴加配制好的TUNEL混合液覆蓋組織，37℃恒溫箱孵育2 h，而后進行DAPI復染細胞核，再用抗熒光淬滅封片劑封片，最后于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。采用凋亡細胞數/胰島總細胞核數×100%，計算凋亡指數（AI），取平均值。

1.5.6 蛋白質印跡法（Western blot)檢測PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1蛋白表達 取胰腺組織加入裂解液研磨，離心后取上清液，采用BCA法測定蛋白質濃度，根據預實驗結果調整各個蛋白的上樣量，上樣后進行電泳、轉膜，并將膜置于封閉液中封閉2 h，后配置合適比例的一抗封閉液（PI3K、AKT、BMAL1稀釋比例 1∶1 000；p-AKT 稀釋比例 1∶800），于 4 ℃孵育過夜后再加二抗封閉液室溫孵育，滴入ECL plus超敏發光液，并采用凝膠成像系統分析灰度值。

1.6 統計學方法 選取SPSS 24軟件進行統計學分析。實驗數據采用均數±標準差（±s）表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，組內前后比較采用配對t檢驗。重復測量資料比較采用重復測量方差分析，P＜0．05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 造模前大鼠精神狀態反應敏捷，行動迅速，毛發光澤，便質成型；造模后精神萎靡，反應遲鈍，瞇眼少動，縮肩拱背，體型消瘦，毛發蓬松，毛色暗黃，食量倍增，頻繁飲水，尿量增加，大便溏稀。干預結束后，針刺組大鼠精神狀態良好，反應敏捷，體質量增加明顯，毛發順澤，食飲水及尿量如常，便質基本成形。

2.2 4 時相血糖值 如表1所示，干預前與空白組比較，模型組與針刺組各時相即時血糖顯著升高（P＜0．01），但針刺組與模型組相比無統計學意義（P＞0．05）。干預后，針刺組較模型組各時相即時血糖顯著下降（P＜0．01），但兩組各時相即時血糖均顯著高于空白組（P＜0．01）。模型組血糖與干預前相比無顯著變化（P＞0．05），而針刺組血糖顯著下降（P＜0．01）。

表1 各組大鼠干預前后0、6、12、18時即時血糖比較（±s）Tab.1 Comparison of 0，6，12，18 hours of glucose levels in rats of each group before and after intervention（±s）mmol/L

表1 各組大鼠干預前后0、6、12、18時即時血糖比較（±s）Tab.1 Comparison of 0，6，12，18 hours of glucose levels in rats of each group before and after intervention（±s）mmol/L

注：同一時相與空白組比較，**P＜0．01；同一時相與模型組比較，##P＜0．01；同一組別與干預前比較，▲▲P＜0．01。

組別 動物數 0時血糖 6時血糖 12時血糖 18時血糖干預前 干預后 干預前 干預后 干預前 干預后 干預前 干預后空白組 10 6．1±0．72 6．1±0．84 6．2±0．65 6．1±0．73 5．5±0．71 5．5±0．63 5．3±0．66 5．1±0．74模型組 10 22．5±0．92** 22．4±1．14** 20．3±1．36** 21．2±1．43** 18．5±1．52** 19．1±1．62** 21．3±1．21**22．0±1．32**針刺組 10 22．6±1．23** 9．0±0．93**##▲▲ 19．5±1．52** 9．4±0．75**##▲▲ 18．8±1．08** 8．5±0．54**##▲▲ 21．5±2．76** 7．7±0．62**##▲▲

2.3 SDBG與LAGE值 如表2所示，干預前與空白組比較，模型組與針刺組SDBG與LAGE顯著升高（P＜0．01），但針刺組與模型組相比無統計學意義（P＞0．05）。干預后，針刺組較模型組SDBG與LAGE顯著下降（P＜0．01），但兩組 SDBG 與 LAGE 均顯著高于空白組（P＜0．01）。模型組 SDBG 與 LAGE 與干預前相比無顯著變化（P＞0．05），而針刺組 SDBG 與LAGE 顯著下降（P＜0．01）。

表2 各組大鼠干預前后SDBG與LAGE值比較（±s）Tab.2 Comparison of SDBG and LAGE levels in rats of each group before and after intervention（±s）mmol/L

表2 各組大鼠干預前后SDBG與LAGE值比較（±s）Tab.2 Comparison of SDBG and LAGE levels in rats of each group before and after intervention（±s）mmol/L

注：與空白組比較，**P＜0．01；與模型組比較，##P＜0．01；與干預前比較，▲▲P＜0．01。

組別 動物數 SDBG LAGE干預前 干預后 干預前 干預后空白組 10 0．6±0．48 0．6±0．36 1．7±1．03 1．7±1．11模型組 10 4．2±0．78**4．3±0．85** 7．0±1．93**7．1±2．09**針刺組 10 4．1±0．63**2．8±0．57**##▲▲ 7．1±2．03**4．8±2．13**##▲▲

2.4 Fins含量 由表3可知，干預前與空白組比較，模型組與針刺組 Fins含量顯著降低（P＜0．01），但針刺組與模型組相比無統計學意義（P＞0．05）。干預后針刺組較模型組Fins含量顯著升高（P＜0．01），但兩組Fins含量均顯著低于空白組（P＜0．01）。模型組 Fins含量與干預前相比無顯著變化（P＞0．05），而針刺組 Fins含量顯著升高（P＜0．01）。

表3 各組大鼠干預前后Fins的比較（±s）Tab.3 Comparison of Fins levels in rats of each group before and after intervention（±s） μU/L

表3 各組大鼠干預前后Fins的比較（±s）Tab.3 Comparison of Fins levels in rats of each group before and after intervention（±s） μU/L

注：與空白組比較，**P＜0．01；與模型組比較，##P＜0．01；與干預前比較，▲▲P＜0．01。

組別 動物數 Fins干預前 干預后空白組 10 72．91±7．62 69．51±3．36模型組 10 36．45±1．58** 37．43±1．65**針刺組 10 35．25±4．76** 54．91±2．38**##▲▲

2.5 胰腺熒光TUNEL染色及AI值 由圖1、表4可知，鏡下空白組胰島未見明顯凋亡，僅有極少量散在綠色著色的凋亡細胞。而模型組可見大量凋亡細胞，AI值則明顯高于空白組（P＜0．01）。經針刺后，針刺組凋亡情況明顯改善，可見夾雜少量凋亡細胞，AI值較模型組明顯下降（P＜0．01）。

圖1 各組胰腺熒光TUNEL染色（×200）Fig.1 Fluorescence TUNEL staining of pancreas of each group(×200)

表4 干預后各組大鼠胰腺細胞凋亡率的比較（±s）Tab.4 Comparison of lslet cell apoptosis rate in rats of each group of after intervention（±s）%

表4 干預后各組大鼠胰腺細胞凋亡率的比較（±s）Tab.4 Comparison of lslet cell apoptosis rate in rats of each group of after intervention（±s）%

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別 動物數 AI空白組 10 2.53±0.79模型組 10 87.32±5.31**針刺組 10 40.59±7.28##

2.6 各組大鼠 PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1 蛋白檢測 由表5、圖2可知，干預后針刺組各蛋白表達較模型組顯著升高（P＜0．01），但均顯著低于空白組（P＜0．01）。

表5 干預后各組大鼠PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1蛋白相對表達量（±s）Tab.5Comparison of PI3K，AKT，p-AKT，BMAL1 levels in rats of each group of after intervention（±s）

表5 干預后各組大鼠PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1蛋白相對表達量（±s）Tab.5Comparison of PI3K，AKT，p-AKT，BMAL1 levels in rats of each group of after intervention（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別 動物數 PI3K AKT p-AKT BMAL1空白組 10 1.02±0.03 0.93±0.04 0.74±0.06 0.81±0.03模型組 10 0.41±0.04** 0.36±0.06** 0.26±0.06** 0.23±0.03**針刺組 10 0.58±0.08**##0.52±0.07**##0.53±0.09**##0.42±0.04**##

圖2 干預后各組大鼠PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1的蛋白表達Fig.2 Protein expression of PI3K，AKT，p-AKT and BMAL1 in rats of each group after intervention

3 討論

人體的生理、代謝方面存在晝夜節律性，這種節律性受體內生物鐘控制。人體生物鐘主要由位于視交叉上核的中央生物鐘和外周生物鐘（如胰島、肝臟、肌肉等）組成。中央生物鐘通過神經、體液調控外周生物鐘，但葡萄糖信號可使外周生物鐘（如胰島）擺脫中央生物鐘控制，而具有相對自主的生物節律，其中胰島的自主生物節律性主要體現在胰島素分泌方面[12]。胰島功能的完整性是胰島素分泌的前提。有資料顯示，T2DM患者胰島分泌的正常節律消失，胰島素脈沖式的分泌模式紊亂，血糖晝夜節律失衡[13]。故恢復胰島功能及正常的“生物鐘效應”對維持T2DM血糖晝夜節律至關重要。

晝夜節律產生和維持的分子機制是由BMAL1與生物鐘循環輸出蛋白（CLOCK）形成異二聚體作為節律性震蕩的起始，隨后與其他時鐘基因結合，形成以約24 h為周期的節律性表達振蕩。PI3K/AKT通路是BMAL1的上游通路，有別于生物鐘基因（CLOCK），BMAL1的缺乏會出現高血糖和葡萄糖刺激下的胰島素分泌紊亂等現象[14]。BMAL1蛋白可與胰島素基因啟動子E-box結合，調控胰島素的表達，并可促進胰島素分泌囊泡的胞吐。敲除BMAL1可影響胰島節律性胞吐[15]。故PI3K/AKT/BMAL1通路與T2DM血糖晝夜節律失衡關系密切。

同時，人體五臟六腑與自然界生物節律亦有聯系，如《靈樞·經別》云：“余聞人之合于天道也，內有五臟，以應五音、五色、五時、五味、五位也；外有六腑，以應六律，六律建陰陽諸經，而合之十二月、十二辰、十二節、十二經水、十二時、十二經脈者，此五臟六腑之所以應天道。”而脾病亦會導致生物節律性的失常，如《素問·藏氣法時論》曰：“脾病者，日昳慧，日出甚，下晡靜。”其中“日出甚”即言明脾病患者在黎明之時病情嚴重，而T2DM的“黎明現象”正是發于此時，這也為生物鐘紊亂從脾論治提供理論依據。同時，血糖是由水谷精微化生而成，源于脾胃的升降運化，故血糖異常亦應從脾論治。《素問·遺篇》曰：“脾者，諫議之官，知周出焉。”筆者認為脾諫議是監督防衛之功的體現。血糖晝夜節律失衡正是由于脾胃受損，脾虛失運，運化失節，諫議失司而引起。因此，提出血糖晝夜節律失衡應從脾論治，調理脾胃升降運化，復其諫議之職，使運化有節。

本研究結果顯示，造模成功后，大鼠顯示出了脾胃升降運化失常所引起的一系列癥狀，如精神萎靡，體型消瘦，毛色暗黃，大便溏稀等。在針刺后上述癥狀較前改善。此外，在正常情況下大鼠血糖分別于6、18時為一晝夜血糖變化的波峰及波谷，并于0、24時回落至基本水平[16]，而T2DM大鼠的血糖則無晝夜波動的節律性，而呈現出異常高水平[17]，故采用4時相即時血糖以評價血糖波動的節律性，但波動的節律性亦不可過度離散，故進一步結合SDBG與LAGE以評價其離散程度。研究表明，干預前由于胰腺的破壞，故胰島素分泌不足，TUNEL染色亦證明胰島細胞存在大量凋亡。因此，干預前針刺、模型組Fins含量較空白組下降，各時相即時血糖、SDBG、LAGE及AI值較空白組升高，血糖晝夜節律失衡。隨著針刺的干預，AI值降低，提示胰島修復，而胰島功能的完整性又是胰島素分泌的前提，隨著胰島修復，胰島素節律性分泌得到改善，針刺組各時相血糖、SDBG、LAGE趨于正常，且針刺結束后Fins含量亦接近空白組，血糖晝夜節律失衡得到糾正。同時，治療前模型組大鼠PI3K/AKT通路各蛋白表達量降低，信號下傳障礙，BMAL1表達量減少，是血糖晝夜節律失衡的機制。但隨著針刺的介入，針刺對PI3K/AKT/BMAL1通路具有良性調節作用，可提高 PI3K、AKT、p-AKT、BMAL1 蛋白的表達量，促進針刺信號的下傳，隨著BMAL1的表達增加，其可促進胰島素生成，改善血糖分泌的節律性，故使各時相血糖下降，血糖晝夜節律得到改善。

調理脾胃針法正是用于治療脾胃升降運化失常的1種針刺方法，中脘可助運化，功善升清降濁；足三里可益脾胃，補臟腑之虛損；陰陵泉可化濕滯，開通水道，上述3個穴位相配健脾祛濕，調中焦之升降運化。三陰交、地機、血海可化血中之濁瘀，祛瘀生新，調和氣血。豐隆可化濕祛痰，和胃降逆。曲池、合谷通降胃腸，蕩滌邪穢。太沖平肝調肝，防肝木橫克脾土。諸穴合用，使升降有序，健運有常，精微得布，臟腑得養，諫議之職可復[18]。