具有質(zhì)量和電化學復合敏感效應的新型QCM生物傳感器研究

潘齊超，張 瞳，張耀鵬，朱 波

(1.東華大學 材料科學與工程學院，纖維材料改性國家重點實驗室，上海 201620; 2.上海大學 材料學院，上海 200444)

0 引言

石英晶體微天平(QCM)是一種對表面質(zhì)量負載變化敏感的傳感器件，可將其表面敏感材料與外界目標物相互作用產(chǎn)生的質(zhì)量變化轉化為頻率變化，具有靈敏度高、操作簡單和可實時檢測等優(yōu)點，被廣泛應用于傳感器領域[1]。

目前，隨著生物檢測領域的迫切需求和液相QCM理論的不斷完備，QCM技術開始越來越多地應用于液相生物傳感器中[2-4]。然而，液相生物環(huán)境中含有多種多肽、核酸和蛋白等干擾物，干擾物的黏附同樣會導致QCM頻率的變化。目前，為了提高傳感器的抗干擾能力，常采用牛血清蛋白等封閉劑對QCM傳感器進行處理[5]，但這種外源封閉劑的方法操作復雜、封閉效果不穩(wěn)定。因此，QCM的抗干擾能力對液相生物分子的檢測至關重要[6]。

電化學傳感技術可將敏感材料與目標物的相互作用直接轉換成電信號，具有結構簡單，選擇性好和靈敏度高等特點。目前QCM傳感器的敏感材料常為非電活性材料，僅可實現(xiàn)傳統(tǒng)的質(zhì)量傳感。如果QCM技術與電化學傳感技術聯(lián)用，可賦予QCM傳感器多重敏感能力，獲得更多的傳感信息并提高其抗干擾能力，有助于拓展其在生物傳感中的應用。

導電高分子材料，尤其是聚3，4乙烯二氧噻吩(PEDOT)類材料具有較低的電化學阻抗、易于功能化、可通過電化學組裝到導電基底等優(yōu)點，可以方便地實現(xiàn)QCM表面的原位組裝，是制備電化學傳感器的優(yōu)選材料[7]。尤其是基于磷酸膽堿功能化的PEDOT材料(PEDOT-PC)，Zhu等[8]和Zhang等[9]證明了PEDOT-PC具備優(yōu)異的抗非特異性黏附能力，并且擁有良好的電化學性能，具有制備高選擇性傳感器的潛力。

針對目前QCM在生物傳感中的問題，本研究將利用電化學原位沉積的方法，以生物素功能化的PEDOT(PEDOT-biotin)作為敏感材料的耦合單元，PEDOT-PC作為敏感材料的抗干擾單元，制備了生物分子敏感的QCM傳感器，其不但具有對鏈霉親和素的質(zhì)量和電化學復合敏感效應，而且具有優(yōu)異抗其他蛋白干擾能力。

1 實驗部分

1.1 藥品及耗材

EDOT-Biotin和EDOT-PC為自制藥品；LiClO4來源于阿拉丁試劑有限公司；乙腈來源于上海凌峰化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、鐵氰化鉀及亞鐵氰化鉀來源于上海泰坦股份科技有限公司；丁二酸二辛酯磺酸鈉(DSS)來源于上海西寶生物科技有限公司；鏈霉親和素和牛血清蛋白(BSA)來源于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；QCM芯片來源于瑞典百歐林(表面鍍金，基頻5 MHz)。

1.2 QCM傳感器的電化學制備方法

分別在含有50 mmol/L DSS和100 mmol/L LiClO4的乙腈溶液中配制10 mmol/L的EDOT-Biotin和EDOT-PC溶液。電化學聚合條件：以QCM芯片為工作電極，鉑網(wǎng)為對電極，Ag/Ag+為參比電極，將不同比例的EDOT-Biotin和EDOT-PC溶液混合并保持單體總濃度在10 mmol/L，通過循環(huán)伏安法對單體進行聚合，掃描速度為0.1 V/s。經(jīng)過聚合試驗步驟后的QCM芯片經(jīng)過乙腈沖洗、氮氣吹干后即可用作為生物分子敏感的QCM傳感器使用。

利用掃描電子顯微鏡(SEM)對樣品形貌表征(型號：Genmini 300，Zeiss；電壓：5 kV)。利用X線光電子能譜分析(XPS)對樣品表面元素進行分析(型號：K-alpha，Thermo Fisher；掃描范圍：400 μm)。利用接觸角對樣品親疏水性進行表征(型號：THETA Auto，Atternsion；液滴大小為3 μL，接觸角計算模型為Young-Laplace)。

1.3 QCM的質(zhì)量和電化學傳感方法

使用配有電化學模塊的瑞典百歐林科技有限公司的Q.Sense E4設備表征樣品對生物分子的傳感能力。測試中流速均固定為30 μL/min，以流入10 min PBS為基線，再流入30 min 鏈霉親和素(50 μg/mL)或BSA(1 mg/mL)做耦合測試，最后流入30 min PBS對測試腔進行清洗。其中當QCM與電化學聯(lián)用時，其測試腔結構如圖1所示。鉑片作為對電極，Ag/AgCl作為參比電極，功能化QCM芯片的正面作為工作電極，流動相中需要加入5 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-作為氧還原探針。循環(huán)伏安法測試條件：掃描范圍為-0.4～0.6 V，掃描速度為100 mV/s。阻抗測試條件：偏壓為OCP，振幅為10 mV，頻率掃描范圍為0.1～100 000 Hz。

圖1 電化學石英晶體微天平裝置圖

2 實驗結果與討論

2.1 生物分子敏感QCM傳感器的制備

功能化EDOT單體可以在施加氧化電勢的條件下發(fā)生聚合，進而原位沉積到QCM芯片上，如圖2(a)所示。EDOT-PC和EDOT-Biotin單體各自的氧化電位不同，為了實現(xiàn)兩者可控的共聚合，本研究引入了DSS作為乳化劑，并且調(diào)控了循環(huán)伏安法的電勢范圍。隨著電勢升高，氧化電流不斷升高，不同共聚比例下的循環(huán)伏安曲線類似，表明功能化EDOT單體發(fā)生了可控的氧化聚合反應，如圖2(c)所示，最終制備了具有均勻表面形貌的敏感材料，如圖2(b)所示。

圖2 電化學聚合、SEM形貌、不同投料比的電化學聚合曲線

為了定量分析敏感材料中不同功能化PEDOT所含的比例，我們通過XPS對敏感材料的表面元素進行了分析。結合能在399.5 eV的峰是EDOT-PC中磷酸膽堿的N+元素引起的，402.5 eV的峰是EDOT-Biotin中生物素中N元素引起的，隨著EDOT-Biotin投料的增加，可以發(fā)現(xiàn)N元素的峰在逐漸增大，同時N+元素的峰在逐漸變小，如圖3(a)所示。通過控制電化學聚合中EDOT-Biotin單體的投料，可以實現(xiàn)敏感材料中EDOT-Biotin的含量控制，如圖3(b)所示。

圖3 不同EDOT-Biotin投料下制備的聚合物的表面元素分析

應用于生物領域的敏感材料，為獲取和生物分子較好的親和力，需要滿足一定的親水性。本研究表征了不同EDOT-Biotin和EDOT-PC投料制備的敏感材料的親疏水性質(zhì)，如圖4所示。PEDOT-PC的接觸角在10°左右，PEDOT-Biotin的接觸角在60°以上，兩者共聚物的接觸角隨著EDOT-Biotin加入量的增加而變大，說明磷酸膽堿基團可顯著降低接觸角,提高敏感材料親水性。

圖4 不同投料下制備的聚合物接觸角數(shù)據(jù)及相應的接觸角照片

2.2 生物分子敏感QCM的傳感性能研究

QCM傳感器的抗干擾能力是由敏感材料的抗非特異性黏附能力決定。本研究利用上述電化學方法在QCM上沉積制備了PEDOT-Biotin-co-PEDOT-PC敏感材料。

當以BSA作為非目標蛋白，可以發(fā)現(xiàn)在50%及以下投料EDOT-Biotin制備的敏感材料幾乎不會出現(xiàn)對高濃度下BSA(1 mg/mL)的非特異性黏附，而100% EDOT-Biotin投料下的敏感材料會導致嚴重的非特異特異性黏附行為，如圖5(a)所示。本研究將鏈霉親和素(50 μg/mL)作為敏感材料捕獲的目標物，其中敏感材料中的Biotin基團可以與鏈霉親和素發(fā)生特異性的結合。隨著EDOT-Biotin投料的增加，敏感材料對鏈霉親和素的傳感能力逐步提高，在50 % EDOT-Biotin投料時擁有最大的傳感能力，如圖5(b)所示。

圖5 利用QCM表征不同投料EDOT-Biotin制備的聚合物膜

綜上說明，功能化QCM傳感器的抗干擾能力來源于材料中的EDOT-PC單元。其中PC基團的陽離子和陰離子是嚴格1∶1存在的，且其空間位置很近，表現(xiàn)出理想的原位電荷中性，不會與生物分子發(fā)生電性吸引，另外PC與水間存在強烈的水合作用[10]，甚至在界面形成冰狀更致密的水分子網(wǎng)絡[11]，生物分子很難克服這層水分子網(wǎng)絡而產(chǎn)生黏附行為。這表明EDOT-PC和EDOT-Biotin修飾的QCM傳感器具備較強的抗干擾能力，并且可以對微克級別的鏈霉親和素實現(xiàn)傳感。

為了進一步研究功能化QCM傳感器的電化學傳感能力，本研究在空白溶液及含有鏈霉親和素的溶液中加入[Fe(CN)6]4-/3-作為氧化還原探針，當敏感材料界面捕獲鏈霉親和素時，鏈霉親和素會阻擋敏感材料界面的電子交換，進而使傳感器的氧化還原電流變低，如圖6(a)所示。同時，功能化QCM與鏈霉親和素作用后，會使QCM傳感器低頻處的阻抗明顯升高，如圖6(b)所示。結果表明，通過電化學氧化還原信號及電化學阻抗信號可以實現(xiàn)對生物分子的傳感，從而實現(xiàn)QCM與電化學的聯(lián)用傳感。

圖6 功能化QCM傳感器在加入鏈霉親和素前后

3 結束語

針對傳統(tǒng)QCM傳感器不適用同時質(zhì)量和電化學傳感的局限性，以及抗干擾能力不足的問題，本研究利用功能化導電高分子優(yōu)異的電化學性能及抗干擾能力，借助電化學沉積的方法成功制備生物分子敏感的QCM傳感器，實現(xiàn)了對鏈霉親和素的質(zhì)量和電化學傳感，同時具備較強抗干擾能力的目標。該生物分子敏感QCM傳感器的制備，將有助于未來開發(fā)高選擇性多重敏感能力的生物分子傳感器。