滌痰解毒方對急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒大鼠阿托品化后血清炎癥因子水平和重要臟器超微結(jié)構(gòu)的影響▲

劉 玲 邵 良 凌 峰 黃 磊 甘 露

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院急危重癥醫(yī)學(xué)科，湖南省株洲市 412000)

有機(jī)磷農(nóng)藥中毒是我國農(nóng)村最常見的農(nóng)藥中毒類型，其病情兇險，死亡率高[1]。急性有機(jī)磷農(nóng)藥中毒(acute organophosphorus pesticide poisoning，AOPP)患者經(jīng)洗胃及靜脈推注阿托品等急救處理后仍然存在極大的生命危險，常需轉(zhuǎn)入重癥監(jiān)護(hù)室繼續(xù)治療。中醫(yī)無AOPP病名，但存在與AOPP臨床表現(xiàn)相似的中醫(yī)癥候群。在AOPP的急救治療達(dá)到阿托品化且可進(jìn)行后續(xù)治療時，患者證型以痰濕內(nèi)阻型最為常見，臨床表現(xiàn)為呼吸氣促、喉間少痰、汗出、腹脹、煩悶不安、頭暈?zāi)垦！⑸嗵Π啄伒劝Y狀，查體肺部聽診有濕啰音。對于此證型，中醫(yī)治療采用解毒祛痰利濕法進(jìn)行治療，臨床實踐表明我科室自擬滌痰解毒方對改善此類患者的預(yù)后有較好效果。本研究從降低炎癥因子，保護(hù)肺、大腦等重要臟器功能的角度，探討滌痰解毒方治療中期AOPP(即AOPP阿托品化后)的作用機(jī)制，為推廣中醫(yī)藥在急危重癥中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠18只，雄性，6周齡，180～200 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司[許可證號：SCXK(湘)2019-0004)]，均給予常規(guī)飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20 ℃～26 ℃，濕度為40%～70%。

1.2 藥物 用生理鹽水將77.5%的敵敵畏(山東大成生物化工有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號：GB 2548-2008)配置成濃度為0.65%敵敵畏溶液，按65 mg/kg的劑量造模。阿托品(安徽長江藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國家準(zhǔn)字H34021900)，解磷定(成都力思特制藥股份有限公司，CAS：19032801)，長托寧(成都力思特制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國家準(zhǔn)字H20020606)。滌痰解毒方的組方包括陳皮15 g、半夏10 g、茯苓20 g、膽南星10 g、竹茹10 g、川芎15 g、枳實10 g、厚樸15 g、瓜蔞15 g、黨參15 g、桔梗15 g、生甘草10 g；取5劑，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科制劑室制備，水提醇沉法制備濃縮液，調(diào)整至相當(dāng)于含生藥材2 g/mL，將pH值調(diào)整至6.5～7.0，4 ℃保存。

1.3 主要試劑 蘇木素染液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZLI-9610)，伊紅染色液、Scott藍(lán)化液(Solarbio公司，批號：G1100、G1865)，超凈高級封片膠(珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：YZB)，大鼠白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β檢測試劑盒、IL-6檢測試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號：MM-0047R1、MM-0190R1)。

1.4 主要儀器 WD-2012B型全自動酶標(biāo)儀(北京六一生物科技有限公司)，BD/BC-415DKEM型冷藏冷凍箱(美的集團(tuán)股份有限公司)，DHP-9054型電熱恒溫培養(yǎng)箱(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)，BL-420S型生物機(jī)能實驗系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)，JEM-1230型透射電鏡(80KV，JEOL Ltd.)。

1.5 實驗方法

1.5.1 建立中期AOPP模型：采用隨機(jī)數(shù)字表法將18只大鼠分成6組，即正常組、模型組、西藥組、等劑量滌痰解毒方組、高劑量滌痰解毒方組、西藥+等劑量滌痰解毒方組，每組3只。根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，除正常組外，其他組均按照65 mg/kg的劑量給予敵敵畏溶液灌胃(每100 g體重灌1 mL敵敵畏溶液)，然后觀察大鼠的癥狀，大鼠一般在10 min內(nèi)均會出現(xiàn)中毒癥狀，表現(xiàn)為全身震顫、四肢僵直、流涎、針尖樣瞳孔，嚴(yán)重者會出現(xiàn)眼鼻出血癥狀。在老鼠四肢僵直無法挪步時，給予大鼠臀部肌內(nèi)注射0.5 mg阿托品+3 mg解磷定解救，以后每隔15 min肌內(nèi)注射0.5 mg阿托品+1.5 mg解磷定，直至阿托品化(瞳孔散大、心率加快等)[2]。

1.5.2 分組及給藥：模型制備成功后，西藥組大鼠給予0.1 mg/kg的長托寧臀部肌內(nèi)注射，等劑量滌痰解毒方組、高劑量滌痰解毒方組大鼠分別按生藥14 g/kg、28 g/kg體重的劑量給予滌痰解毒方灌胃，西藥+等劑量滌痰解毒方組大鼠給予0.1 mg/kg的長托寧臀部肌內(nèi)注射和14 g/kg滌痰解毒方灌胃。所有大鼠的中藥灌胃2次/d，長托寧肌內(nèi)注射2次/d。模型組按照每100 g體重1 mL給予溫開水灌胃，2次/d。

1.5.3 觀察指標(biāo)：治療24 h后處死所有大鼠，心臟采血10 mL，采用低溫離心機(jī)以3 000 r/min離心10 min，常規(guī)分離血清，于-70 ℃冰箱內(nèi)凍存，采用ELISA檢測血清IL-1β、IL-6水平。采血后取大鼠大腦皮層組織、海馬組織及肺組織，進(jìn)行固定、脫水、包埋、固化處理后在電鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graphpad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清IL-1β和IL-6水平的比較 與正常組相比，模型組血清IL-1β水平升高(P<0.05)；與模型組相比，西藥+等劑量滌痰解毒方組、等劑量滌痰解毒方組、高劑量滌痰解毒方組的血清IL-1β水平降低(均P<0.05)，但各藥物干預(yù)組之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。6組間血清IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 6組大鼠血清IL-1β和IL-6水平的比較(x±s，pg/mL)

2.2 各組大鼠肺組織、海馬、大腦皮質(zhì)組織的超微結(jié)構(gòu) 經(jīng)治療后，各個藥物干預(yù)組大鼠的肺組織、海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)組織、腦皮質(zhì)細(xì)胞損傷程度均較模型組有所改善。見圖1、圖2、圖3。

圖1 6組大鼠肺組織電鏡下的超微結(jié)構(gòu)(×18 500)

圖2 6組大鼠海馬組織電鏡下的超微結(jié)構(gòu)(×18 500)

圖3 6組大鼠腦皮質(zhì)組織電鏡下的超微結(jié)構(gòu)(×18 500)

3 討 論

AOPP病情兇險，病死率高，全球范圍內(nèi)每年約有100萬人發(fā)生有機(jī)磷中毒，嚴(yán)重危及患者的生命安全[3-5]。AOPP常用的治療方案為阿托品與血液灌流聯(lián)合治療，及時、足量、重復(fù)給藥直至達(dá)到阿托品化，該方案可在一定程度上可緩解AOPP患者的癥狀[6-7]，但阿托品化后患者常出現(xiàn)頭痛眩暈、心煩失眠、多夢、胸悶納呆、倦怠無力等后遺癥。中期AOPP患者常表現(xiàn)為呼吸氣促、喉間少痰、汗出、腹脹、煩悶不安、頭暈?zāi)垦！⑸嗵Π啄伒劝Y狀，查體肺部聽診可有濕啰音，中醫(yī)辨證應(yīng)為痰濕內(nèi)阻，根據(jù)這些證型，可以采用祛痰利濕法治療，我科自擬滌痰解毒方治療中期AOPP，重在宣肺祛痰，改善患者的呼吸功能。滌痰解毒方的組方為陳皮15 g、半夏10 g、茯苓20 g、膽南星10 g、竹茹10 g、川芎15 g、枳實10 g、厚樸15 g、瓜蔞15 g、黨參15 g、桔梗15 g、生甘草10 g。其中陳皮、膽南星、半夏、瓜蔞清熱袪痰，枳實破痰利膈，竹茹清化熱痰解郁，桔梗宣肺化痰，厚樸行氣化痰消腹脹，川芎補(bǔ)益氣血、活血化瘀，人參、茯苓、甘草補(bǔ)心益脾、益氣固表。綜合全方，即祛痰宣肺，兼補(bǔ)氣血，驅(qū)邪固本，標(biāo)本兼顧，結(jié)合西醫(yī)治療，可用于AOPP阿托品化后的治療，改善患者預(yù)后。

研究表明，當(dāng)大量有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)入機(jī)體后，機(jī)體免疫系統(tǒng)啟動應(yīng)激反應(yīng)，生成大量促炎癥細(xì)胞因子，導(dǎo)致患者發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)一步發(fā)展至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[8-9]。另有研究顯示，AOPP激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，使 IL-1β、IL-6等炎癥因子水平升高，引起瀑布效應(yīng)，進(jìn)而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至臟器功能衰竭[10]。所以，早期清除AOPP患者體內(nèi)的炎癥細(xì)胞因子是阻止MODS發(fā)生的關(guān)鍵。本研究中，AOPP大鼠阿托品化后血清中炎癥因子IL-1β水平升高(P<0.05)，符合有機(jī)磷農(nóng)藥中毒后炎癥因子爆發(fā)的病理反應(yīng)；西藥+等劑量滌痰解毒方、等劑量滌痰解毒方、高劑量滌痰解毒方治療均能降低AOPP阿托品化后大鼠血清炎癥IL-1β水平(P<0.05)，說明滌痰解毒方單獨或聯(lián)合長托寧在緩解AOPP大鼠阿托品化后的炎癥反應(yīng)均有較好效果。雖然各藥物干預(yù)組的血清IL-6水平也有所降低，但差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，考慮與樣本量小有關(guān)。

AOPP最常見且最為嚴(yán)重的并發(fā)癥為呼吸衰竭， 包括中樞性呼吸衰竭與周圍性呼吸衰竭[11]。其中，中樞性呼吸衰竭主要是由呼吸中樞被有機(jī)磷直接或間接抑制而導(dǎo)致，多發(fā)生在中毒24 h以內(nèi)。有機(jī)磷農(nóng)藥可引起嚴(yán)重的腦干損傷，病理表現(xiàn)主要為腦干水腫、出血，神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死，這些腦干呼吸中樞的損傷可直接引起呼吸衰竭。本研究的電鏡結(jié)果顯示，模型組中大鼠出現(xiàn)肺泡間隔水腫，肺泡間質(zhì)中膠原沉積較多，肺泡腔有滲出，海馬的結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重、神經(jīng)細(xì)胞核嚴(yán)重固縮、線粒體腫脹，且腦膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，核內(nèi)染色質(zhì)溶解，符合AOPP后肺部和中樞神經(jīng)損傷的表現(xiàn)。滌痰解毒湯單獨或聯(lián)合長托寧均可減少大鼠肺組織膠原蛋白沉積，減輕肺組織纖維化，從而達(dá)到延緩呼吸衰竭進(jìn)程效果；可阻滯神經(jīng)細(xì)胞核固縮，減輕線粒體腫脹及血管周圍足突腫脹，防止腦干水腫、神經(jīng)細(xì)胞凋亡，避免因腦干呼吸中樞損傷致呼吸衰竭。

綜上所述，滌痰解毒方可通過抑制炎癥因子釋放、延緩肺纖維化進(jìn)程、減輕腦組織損傷，促進(jìn)AOPP大鼠阿托品化后機(jī)體的恢復(fù)。