血清循環游離DNA聯合HE4、CA15-3、CYFRA21-1對卵巢癌診斷和分期評估的價值▲

朱玉鳳 歐陽海紅 羅浩明 王小鳳 陳建設

(1 湖南省邵陽市中心醫院檢驗科，湖南省邵陽市 422000； 2 湘南學院公共衛生學院，湖南省郴州市 423000)

卵巢癌是女性生殖系統的惡性腫瘤之一，是致死率最高的婦科腫瘤，其發病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌[1]。由于卵巢腫瘤早期癥狀不明顯，僅有少數卵巢癌患者在Ⅰ期獲得診斷，多數患者確診時已進展至中晚期，其惡性程度高、易發生轉移，患者5年生存率低[2]。因此，早期診斷對于及時治療和改善卵巢癌患者的預后具有重要意義[3]。循環游離 DNA(circulating free DNA，cf-DNA)是指循環血中游離于細胞外的高度片段化DNA，cf-DNA在甲狀腺癌、食管癌等多種腫瘤中的表達水平升高，對腫瘤具有一定的診斷價值[4-5]。人附睪蛋白4(human epididymal protein 4，HE4)是一種腫瘤標志物，其在卵巢癌組織中呈高水平表達，在鑒別診斷良惡性卵巢腫瘤和不同分期卵巢癌中具有一定價值[6]。糖蛋白抗原15-3(carbohydrate antigen 15-3，CA15-3)是一種常用的腫瘤標志物，可用于診斷早期卵巢癌[7]。細胞角質蛋白19片段抗原21-1(cytokeratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1)存在于腫瘤細胞的上皮胞質中，當組織發生癌變時，角蛋白被降解，血液中CYFRA21-1水平升高[8]。有研究表明，卵巢癌患者血清CYFRA21-1水平明顯升高，且與病情嚴重程度有關[9]。本研究以病理診斷結果為金標準，探討血清cf-DNA聯合HE4、CA15-3、CYFRA21-1在卵巢癌診斷和分期評估中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年7月至2020年10月在湖南省邵陽市中心醫院就診的91例卵巢癌患者為卵巢癌組，年齡20～73(47.20±7.50)歲，其中國際婦產科協會分期Ⅰ～Ⅱ期37例(早期組)、Ⅲ～Ⅳ期54例(中晚期組)。納入標準：(1)所有患者均接受手術治療，術后經病理檢查確診為卵巢癌；(2)初次發病；(3)術前未接受放化療；(4)患者對本研究知情同意并配合完成相關檢查。排除標準：(1)合并免疫性疾病、嚴重精神病等其他嚴重疾病者；(2)伴有其他類型腫瘤或者卵巢癌復發患者；(3)臨床資料不全者。另選取同期88例卵巢良性腫瘤患者作為卵巢良性腫瘤組，其中成熟性畸胎瘤25例、黏液性囊腺瘤35例、卵巢子宮內膜異位囊腫28例，年齡 22～72(47.50±7.30)歲。納入標準：(1)經病理診斷為卵巢腫瘤良性病變；(2)無其他惡性腫瘤病史。排除標準：合并精神疾病或不能配合完成相關檢查。選取同期健康體檢女性90例為對照組，年齡23～72(47.30±7.20)歲。納入標準：(1)無任何惡性腫瘤疾病史或家族史；(2)無免疫性疾病或其他疾病者。排除標準：(1)感染性疾病、精神疾病等其他疾病患者；(2)卵巢疾病患者。3組研究對象的年齡差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經過湖南省邵陽市中心醫院醫學倫理委員會批準(批準文號：20180019)，所有研究對象均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的檢測方法

1.2.1 主要試劑與儀器： cf-DNA快速提取試劑盒(Epigenetics公司，批號：QE0905T)，人類基因組DNA標準品(Promega公司，批號：D1521)，HE4 ELISA試劑盒(R&D systems公司， 批號：DHE400)，CYFRA21-1 ELISA試劑盒(Elabscience Biotechnology Co.,Ltd，批號：E-EL-H2077c),CA15-3檢測試劑盒(上海羅氏制藥有限公司，批號：329583)。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。E601型電化學發光儀購自上海羅氏制藥有限公司。

1.2.2 樣品采集及保存：采集所有觀察對象清晨空腹靜脈血4 mL，在室溫條件下靜置30 min后，以3 000 r/min離心15 min收集血清，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測血清cf-DNA水平：使用cf-DNA快速提取試劑盒提取血清總cf-DNA，-20 ℃保存備用。以人端粒酶逆轉錄酶短片段基因為靶序列， 采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游引物序列為5′-AGCCGTGTTCTTTGCACTTT-3′，下游引物序列為5′-CAGAGGCGTACAGGGATAGC-3′。采用實時熒光定量PCR檢測血清cf-DNA水平。PCR反應體系共25 μL，包括SYBR? Premix Ex Taq 10 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL、上下游引物各0.2 μL、模板cf-DNA 1 μL、血清cf-DNA 2 μL，加雙蒸水至25 μL。擴增條件為預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s，退火95 ℃ 5 s，延伸60 ℃ 30 s，共40個循環。以人類基因組DNA為標準品，按10倍梯度進行連續稀釋，根據標準品的濃度梯度由PCR儀自動分析繪制標準曲線，然后根據標準曲線計算cf-DNA水平。

1.2.4 檢測血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平：采用ELISA檢測血清HE4、CYFRA21-1水平，采用化學發光法檢測CA15-3水平，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

1.3 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；不符合正態分布的計量資料以 [M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多個獨立樣本的比較采用 Kruskal-WallisH檢驗；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析血清cf-DNA聯合HE4、CA153、CYFRA21-1診斷卵巢癌和評估分期的價值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的比較 對照組、卵巢良性腫瘤組、卵巢癌組的血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平依次升高(均P<0.05)。見表1。

表1 3組血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的比較[M(P25，P75)]

2.2 不同分期卵巢癌患者血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的比較 與早期組比較，中晚期組患者的血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均升高(均P<0.05)，見表2。

表2 不同分期卵巢癌患者血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平的比較[M(P25，P75)]

2.3 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平單獨或聯合診斷卵巢癌的價值 采用約登指數最大法確定單一指標的診斷臨界值，采用Logistic模型的預測概率得到4個指標聯合診斷的標準。血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平聯合診斷卵巢癌的敏感度、特異度、曲線下面積(area under the curve,AUC)高于或大于單一指標診斷(均P<0.05)，見表3、表4和圖1 。

表3 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平單獨或聯合診斷卵巢癌的價值

表4 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平聯合診斷與單獨診斷卵巢癌效能的比較

圖1 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平單獨診斷及聯合診斷卵巢癌的ROC曲線

2.4 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平單獨或聯合評估卵巢癌分期的價值 采用約登指數最大法確定單一指標的診斷臨界值，采用Logistic模型的預測概率得到4個指標聯合診斷的標準。血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1聯合診斷早期卵巢癌的AUC為0.970，敏感度為89.19%，特異度為98.15%，AUC與特異度均大于或高于單一指標診斷，見表5、表6、圖2。

表5 血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平單獨診斷或聯合診斷早期卵巢癌的效能

表6 血清cf-DNA、HE4、CA153、CYFRA21-1水平聯合診斷與單獨診斷早期卵巢癌效能的比較

圖2 血清 cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平單獨診斷或聯合診斷早期卵巢癌的ROC曲線

3 討 論

卵巢腫瘤是女性常見的生殖系統腫瘤，卵巢癌早期癥狀不明顯或缺乏特異癥狀，多數患者確診時已處于中晚期。由于卵巢癌侵襲力強、復發率高、缺乏有效治療方法，患者的預后較差，其是導致婦科癌癥患者死亡的主要原因，因此有效鑒別卵巢腫瘤的良惡性并盡早治療，對提高患者生存期具有重要意義[10-12]。

cf-DNA是一種游離DNA，主要來源于壞死或凋亡的腫瘤細胞，健康人血液中的cf-DNA水平較低，在腫瘤患者血液中cf-DNA 水平增高，因此cf-DNA 在腫瘤的診斷中具有重要意義[13-14]。有研究表明，與良性卵巢腫瘤組和健康卵巢組相比，卵巢癌組的cf-DNA水平顯著升高，與Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌患者相比，Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌患者的cf-DNA水平顯著升高[15]。胡秋博等[16]的研究表明，卵巢癌患者血漿cf-DNA水平高于健康女性，且與腫瘤體積的對數值呈正相關，將其用于區分卵巢癌患者與健康女性有一定價值。本研究結果顯示，與健康女性比較，卵巢良性腫瘤患者和卵巢癌患者血清cf-DNA水平均升高，而卵巢癌患者血清cf-DNA水平高于卵巢良性腫瘤患者，且中晚期卵巢癌患者血清cf-DNA水平高于早期卵巢癌患者(均P<0.05)，與既往研究結果[16]相似，這提示血清cf-DNA水平有助于卵巢癌的診斷及其分期的評估。

HE4屬于乳清酸性蛋白家族成員，其在卵巢癌患者血清中的表達水平較高，是卵巢癌臨床診斷和預后評估的理想腫瘤標志物，但是其診斷早期卵巢癌的敏感性與特異性不高[17]。CA15-3為臨床最常見的腫瘤標志物，在女性惡性腫瘤中的表達顯著升高，如卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌等，其表達組織特異性較高，被認為是乳腺癌特異性最高的標志物，在乳腺腫瘤的鑒別診斷中應用廣泛[18]。CYFRA21-1是一種新發現的上皮來源性質的腫瘤標志物，在乳腺癌中表達水平較高，且與乳腺癌的臨床分期有關，CYFRA21-1在胃癌與肺癌患者血清中的表達水平也較高，其對惡性腫瘤的診斷具有一定價值[19-20]。本研究結果顯示，與對照組比較，卵巢良性腫瘤組和卵巢癌組的血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均升高；與卵巢良性腫瘤組比較，卵巢癌組的血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均升高，且中晚期卵巢癌患者的血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平均高于早期卵巢癌患者(均P<0.05)，表明血清HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平升高對卵巢癌的診斷及分期評估可能均有一定指示作用。

繪制ROC曲線進一步評價4個指標的診斷效能，結果提示血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平在診斷卵巢癌和評估卵巢癌分期中均具有一定的效能，但單獨診斷效能不高，且敏感度、特異度不高；而血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1聯合診斷卵巢癌和評估卵巢癌分期的AUC均>0.95，診斷效果好，且四者聯合診斷卵巢癌的AUC、敏感度與特異度大于或高于單一指標診斷，四者聯合診斷早期卵巢癌的AUC、特異度大于或高于單一指標診斷(均P<0.05)。這提示血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1聯合檢測在卵巢癌的診斷和分期評估中均具有較高的價值。

綜上所述，卵巢癌患者血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平升高，在中晚期患者中四者明顯升高，血清cf-DNA、HE4、CA15-3、CYFRA21-1水平聯合檢測對卵巢癌的診斷和分期評估均有較高的效能，具有一定的臨床應用意義。