子癇前期孕婦血清鋅水平與臨床指標、炎癥指標的相關性及其對HUVEC炎癥反應的影響▲

高麗娜 董 燕 劉小玲 何曉春 張玉芳 張 莉 孫 俊 劉小暉

(甘肅省婦幼保健院產二科，甘肅省蘭州市 730050)

子癇前期是一種妊娠期常見的多系統功能紊亂疾病，占所有妊娠并發癥的5%～7%，是孕產婦和圍產兒死亡的主要原因之一[1]。目前普遍認為子癇前期的發病機制是胎盤滋養細胞侵襲遷移不足，子宮螺旋動脈重構受阻，胎盤缺血缺氧，導致炎性因子釋放到母體血液中，從而引起一系列臨床癥狀[2-3]。研究證實，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和白細胞介素(interleukin,IL)-6是引起子癇前期患者全身血管內皮細胞功能障礙和加重母體炎癥反應的關鍵介質[4]。研究表明，脂多糖可誘導血管內皮損傷及炎癥反應，參與子癇前期的發生和發展[5-6]，但其具體機制尚不完全清楚。近年來有研究顯示，人體血清微量元素鋅參與機體多種物質的合成和代謝，鋅代謝紊亂可引起機體免疫系統功能障礙及血管內皮炎癥損傷，從而誘發子癇前期[7]。本研究通過探討子癇前期孕婦血清鋅水平與臨床指標、炎癥指標(TNF-α和IL-6)之間的相關性，同時采用脂多糖誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)模擬子癇前期內皮炎癥反應，探討鋅對HUVEC炎癥反應的改善作用，為子癇前期的診斷和防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2020年10月在甘肅省婦幼保健院住院的105例子癇前期孕婦為子癇前期組，納入標準：符合子癇前期的診斷標準。另選擇同期住院的100例健康孕婦作為對照組，納入標準：因胎位不正 、瘢痕子宮、高齡、社會因素等原因行剖宮產。兩組排除標準：(1)合并原發性腎臟疾病、糖尿病、甲狀腺疾病、高血壓病的患者；(2)雙胎或多胎妊娠；(3)復發性流產、胎兒宮內生長受限、胎盤早剝、血栓形成等患者。子癇前期組孕婦年齡18～40(30.59±5.01)歲，入組時孕周32～40(36.93±2.76)周，身高153.0～170.5(165.20±5.19)cm，入組時體重62.5～85.5(76.70±8.67)kg。對照組孕婦年齡22～38(29.50±2.56)歲，入組時孕周36～40(37.50±1.16)周，身高150.5～168.5(164.20±5.45)cm，入組時體重55.3～80.3(69.70±7.16)kg。兩組孕婦的年齡、孕周、身高差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。所有孕婦均簽署知情同意書，本研究經甘肅省婦幼保健院醫學倫理委員會審查批準(2022GSFY倫審[21]號)。

1.2 主要試劑與材料 HUVEC(上海雅吉生物科技有限公司)；ZnSO4(Sigma Aldrich Lab & Production Materials公司，批號：M2643-500G)；CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：CA1210)；胎牛血清(Gibco公司，批號：26140079)，RPMI-1640高糖培養基(Gibco公司，批號：C11965500BT)；脂多糖(Sigma Aldrich Lab & Production Materials公司，批號：017M4112V)；青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶消化液、總蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號：C0222、C0204、P0010S)；TNF-α兔抗人一抗[艾比瑪特醫藥科技(上海)有限公司，批號：PY19810]； IL-6兔抗人一抗[艾比瑪特醫藥科技(上海)有限公司，批號：PY6087]；β-actin(Santa Cruz公司，批號：sc-47778HRP)；GAPDH(沈陽萬類生物科技有限公司，批號：WL01114)；總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，批號：DP430]；反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司，批號：RR037A、RR420A)；TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司，批號：300-01BH、AF-200-06)；引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3 研究方法

1.3.1 檢測兩組孕婦血清鋅和炎癥因子水平：采集兩組孕婦入院時空腹肘靜脈血5 mL，靜置30 min后，以3 500 r/min離心5 min(離心溫度4 ℃)，吸取上層血清冷凍保存。取適量血清樣本用去離子水稀釋2倍后，置于原子吸收分光光度計(北京中興百匯科技有限公司，型號：BH2100T)上，采用原子吸收光譜法測定血清鋅水平。另取適量血清采用ELISA檢測TNF-α、IL-6水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 收集子癇前期組孕婦的臨床指標及新生兒出生體重：收集子癇前期組孕婦入院時的血壓，測量前囑孕婦休息5 min并且排空膀胱，用水銀血壓計測量血壓兩次，取兩次讀數的平均值并記錄。收集子癇前期組孕婦入院后留取的24 h尿液作為尿蛋白檢測標本，采取免疫比濁法檢測24 h尿蛋白。記錄子癇前期組新生兒的出生體重。

1.3.3 細胞培養：將HUVEC接種于細胞培養瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640高糖培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱內進行培養，每2～3 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代1次，待細胞密度達85%～90%時用0.25%胰蛋白酶消化后吹打細胞，將細胞接種至96孔板，待細胞融合至70%～80%進行后續實驗。

1.3.4 ZnSO4最佳干預濃度的篩選：將生長對數期的HUVEC以100 μL/孔接種至96孔板中，繼續置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞融合至80%時，分別加入不同濃度ZnSO4(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L)處理24 h，然后每孔加入 10 μL CCK-8試劑，放至37 ℃、5% CO2培養箱中共同孵育4 h，取出培養板，置于酶標儀(北京德泉興業商貿有限公司，型號：Epoch)上檢測各孔在波長490 nm處的吸光度值，以空白組(不加任何試劑)作為參照，計算存活率(%)=各組干預后24 h吸光度值/空白組干預前的吸光度值×100%。隨后在空白組及各個不同ZnSO4濃度組中加入100 ng/mL脂多糖，刺激12 h后再次檢測細胞在波長490 nm處的吸光度值， 以空白組作為參照，計算存活率(%)=各組干預后24 h吸光度值/空白組干預前吸光度值×100%。上述實驗均重復3次。

1.3.5 ZnSO4對脂多糖誘導的HUVEC炎癥反應的干預：對照組(無任何處理)、ZnSO4組(100 μmol/L ZnSO4處理24 h)、脂多糖組(100 ng/ mL脂多糖刺激12 h)、脂多糖+ZnSO4組(100 μmol/L ZnSO4處理24 h后再用100 ng/mL脂多糖刺激12 h)。細胞接受不同的刺激處理后置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，以備后續實時熒光定量PCR檢測和Western blot檢測。各組均設置3個復孔。

1.3.6 實時熒光定量PCR檢測各組HUVEC中TNF-α和IL-6 mRNA表達水平：按照總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，用分光光度計(SimpliNano公司)分析RNA純度及濃度，按反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA，進行實時熒光定量PCR。實時熒光定量PCR反應體系(共20 μL)包括TB Green Premix Ex TaqⅡ 10 μL、上下游引物各0.8 μL、RNase Free ddH2O 6.4 μL、cDNA 2 μL。IL-6上游引物為5′-ACTTCACAGAGGATACCAC-3′，下游引物為5′-GCATCATCGCTGTTCATAC-3′；TNF-α上游引物為5′-GGACTAGCCAGGAGGGAGAACAG-3′，下游引物為5′-GCCAGTGAGTGAAAGGGACAGAA-3′；GAPDH上游引物為5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游引物為5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。反應條件：95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性 5 s、57 ℃退火34 s，擴增40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算TNF-α、IL-6 mRNA相對表達水平。上述實驗重復3次。

1.3.7 Western blot測定各組HUVEC中TNF-α、IL-6蛋白表達水平：提取各組細胞的總蛋白，取30 μg蛋白樣品于12%分離膠和4%濃縮膠中進行SDS-PAGE電泳；將蛋白質濕轉至PVDF膜；用5%脫脂牛奶封閉2 h后，PBST洗滌3次，10 min/次；加入TNF-α、IL-6相應一抗各10 μL(稀釋比均為1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜；PBST洗滌3次，10 min/次；加入10 μL辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(稀釋比為1 ∶5 000)，室溫孵育2 h；PBST洗滌3次，10 min/次。使用ECL發光顯色，以GAPDH為內參(稀釋比為1 ∶5 000)，應用Image Lab軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析，實驗重復3次。

1.4 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用Pearson檢驗分析指標間的相關性。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組孕婦血清鋅、TNF-α和IL-6水平的比較 子癇前期組孕婦血清鋅水平低于對照組，血清TNF-α和IL-6水平均高于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組孕婦血清鋅、TNF-α和IL-6水平的比較(x±s)

2.2 子癇前期孕婦血清鋅水平與臨床指標、炎癥指標的相關性分析 子癇前期孕婦血清鋅水平與收縮壓、舒張壓、24 h尿蛋白水平和血清TNF-α、IL-6水平均呈負相關(r=-0.374，P<0.001；r=-0.380，P<0.001；r=-0.396，P<0.001；r=-0.667，P<0.001；r=-0.723，P<0.001)，與新生兒出生體重呈正相關(r=0.292，P<0.001)。

2.3 不同濃度ZnSO4對 HUVEC存活率的影響 HUVEC存活率有隨ZnSO4濃度升高而降低的趨勢，與空白組比較，100 μmol/L ZnSO4組、150 μmol/L ZnSO4組和200 μmol/L ZnSO4組的存活率均降低(均P<0.05)，見表2。經脂多糖刺激后HUVEC存活率均降低(均P<0.05)，其中在ZnSO4濃度為100 μmol/L時HUVEC的存活率最高(均P<0.05)，為干預細胞的最佳濃度，故選用100 μmol/L ZnSO4濃度進行后續實驗，見表3。

表2 不同濃度ZnSO4對HUVEC存活率的影響(x±s，%)

表3 不同濃度ZnSO4對脂多糖處理后的HUVEC存活率的影響(x±s，%)

2.4 ZnSO4對脂多糖誘導的HUVEC炎癥反應的影響 ZnSO4組TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達水平與對照組相比，差異均無統計學意義(均P>0.05)；脂多糖組 TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達水平均高于對照組(均P<0.05)； 脂多糖+ZnSO4組TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達水平均低于脂多糖組(均P<0.05)。見表4。

表4 4組HUVEC中TNF-α、IL-6的mRNA和蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

近年來，子癇前期的發生率和病死率不斷上升[9]，嚴重影響孕婦的生命健康及胎兒的生長發育，其發病機制至今仍未完全明確，因此尋找子癇前期的有效防治策略仍是世界性難題。子癇前期發病機制涉及多方面因素，包括血管內皮功能障礙、過度炎性反應、胎盤滋養細胞侵襲遷移不足、母胎免疫耐受異常等[8]。其中血管內皮功能障礙及過度炎性反應是引起子癇前期相關臨床表現的重要因素。在正常妊娠過程中，孕婦處于輕微持續炎癥狀態，而子癇前期孕婦體內促炎細胞因子水平明顯升高，抗炎細胞因子水平明顯下降，導致孕婦體內出現過度的全身炎癥反應[9]。研究證實，TNF-α和IL-6在子癇前期患者血清及胎盤組織中均呈高表達[10]。在胎盤形成時期，異常增高的TNF-α破壞胎盤結構的發育，打破母體循環中血管舒張因子和血管收縮因子的平衡，而IL-6阻礙滋養細胞侵襲遷移，使子宮螺旋動脈重塑失敗，減少母體血管舒張因子的釋放[11]；在妊娠中晚期，TNF-α和IL-6共同影響腎素-血管緊張素系統、交感神經系統等血壓調節系統，使孕婦血壓進一步增高，加重腎臟功能損害[12]。有學者在腎素-血管緊張素系統障礙所誘發的子癇前期小鼠模型中也發現了TNF-α和IL-6異常增高[13]。在子癇前期患者的血管內皮中，TNF-α和IL-6可以激活內皮細胞以產生黏附分子，并上調血管收縮因子內皮素-1水平，從而引起血管內皮損傷，導致全身血管內皮功能障礙[14]。同時，TNF-α可破壞其他促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間的平衡[15]，使子癇前期患者的病情進一步加重[16]。本研究結果顯示，子癇前期孕婦血清TNF-α和IL-6水平均高于正常孕婦(均P<0.05)，說明炎癥反應在子癇前期的發病過程中可能發揮重要作用。炎性反應被過度激活的過程受到多種因素的影響，尤其是微量元素[17]。近年來有研究顯示，微量元素是維持機體正常免疫應答、免疫監測和免疫自穩的重要因素之一[18-19]。脂多糖可引起血管內皮功能障礙[6]，可模擬子癇前期出現的血管內皮炎癥反應[5]，因此，本研究采用脂多糖誘導HUVEC炎癥反應，探究鋅對內皮細胞炎癥反應的影響。

鋅是妊娠期必需的微量營養素，其參與胎盤及胎兒的發育[20]，同時也是維持細胞穩態、細胞功能及免疫調節的必需元素[21]。鋅在體內的代謝處于動態平衡，其代謝紊亂可引起機體免疫功能障礙，引發一系列與免疫損傷有關的癥狀[22]。子癇前期也是一種免疫炎性疾病， 鋅代謝失衡可能增加子癇前期易患性，并對子癇前期的發生和發展產生一定影響[23]。Wibowo等[24]的研究顯示，與正常孕婦相比，妊娠期高血壓患者血清鋅水平明顯降低。本研究結果顯示，子癇前期孕婦血清鋅水平低于正常孕婦(P<0.05)，與上述研究結果一致。本研究還發現，子癇前期孕婦血清鋅水平與收縮壓、舒張壓、24 h尿蛋白水平呈負相關，與新生兒出生體重呈正相關(均P<0.05)，因此推測鋅可能參與子癇前期的發生和發展，同時也參與胎兒生長發育的調控。鋅在體內參與多種酶和活性因子的組成，可以直接促進蛋白質之間的相互作用，并可調節基因表達和免疫炎性反應等[25]。鋅是細胞內的第二信使，隨著細胞內環境的改變，鋅的濃度也隨之發生改變，同時鋅也能改變細胞內的信號傳導[26]。因此，鋅對于維持細胞正常生理活動及功能有著極其重要的作用。缺鋅可引起免疫缺陷，增加炎性因子的釋放，如IL-6、IL-1β及TNF-α等[27]。本研究結果顯示，子癇前期患者血清鋅水平與TNF-α、IL-6水平呈負相關(均P<0.05)，提示鋅可能是子癇前期患者機體免疫炎性反應被過度激活的重要信號因子。本研究采用ZnSO4處理 HUVEC 24 h 后再用脂多糖刺激12 h，結果顯示，脂多糖+ZnSO4組TNF-α和IL-6的mRNA和蛋白表達水平均低于脂多糖組(均P<0.05)，表明鋅可以下調脂多糖誘導的HUVEC炎性因子表達水平，對HUVEC有一定保護作用，從而抑制子癇前期炎性反應。

綜上所述，子癇前期患者血清鋅水平與臨床指標、炎癥指標存在相關性，鋅可減輕脂多糖誘導的HUVEC炎癥反應，鋅可能參與子癇前期的發生和發展。因此，對于子癇前期高危人群，動態監測妊娠期間血清鋅水平，并指導孕婦合理攝入含鋅食物，對于預防子癇前期的發生具有重要的臨床意義。