lncRNA THRIL在ICU膿毒癥患者血清中的表達(dá)水平及臨床價值

楊志勇,劉維娜

西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,陜西西安 710100

膿毒癥是機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙性疾病，通常伴隨嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克和大手術(shù)，臨床表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)大量釋放到外周血中，該病是重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)的常見病[1]。嚴(yán)重膿毒癥或膿毒性休克導(dǎo)致的病死率預(yù)計為28%～50%[2]，其原因之一是膿毒癥的臨床癥狀不典型，若根據(jù)微生物培養(yǎng)及藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床使用抗菌藥物，會延誤患者病情，進(jìn)而增加死亡風(fēng)險。因此，尋找膿毒癥進(jìn)展的生物標(biāo)志物對于膿毒癥的診斷、治療及預(yù)后至關(guān)重要。有多個研究證實(shí)長鏈非編碼RNA(lncRNA)與膿毒癥的進(jìn)程密切相關(guān)，其調(diào)控機(jī)制也有了一些報道[3-6]。長鏈非編碼RNA-腫瘤壞死因子相關(guān)異種核糖核蛋白(lncRNA THRIL)可通過調(diào)控腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達(dá)及活性而參與炎性反應(yīng)[7-8]，但其在膿毒癥中的作用如何報道較少，故本研究探討膿毒癥患者血清lncRNA THRIL的表達(dá)情況及其與膿毒癥嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年9月至2021年9月在本院ICU治療的膿毒癥患者作為試驗組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2016年美國重癥醫(yī)學(xué)會與歐洲重癥醫(yī)學(xué)會聯(lián)合發(fā)布的《膿毒癥的定義與診斷標(biāo)準(zhǔn)》[9]；(2)年齡≥18歲，<75歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<18歲者；(2)自身免疫缺陷綜合征患者或近半年使用免疫抑制劑者；(3)合并惡性腫瘤者；(4)妊娠期或哺乳期女性；(5)嚴(yán)重肝腎功能障礙者；(6)惡性血液病或血液傳染病者。試驗組共入組117例：其中男60例，女57例；年齡29～71歲，平均(59.29±12.28)歲；一般膿毒癥33例，嚴(yán)重膿毒癥46例，膿毒性休克38例；按照急性生理學(xué)與慢性健康狀況評分Ⅱ(APACHEⅡ評分)，該評分系統(tǒng)包括年齡、格拉斯哥昏迷評分(GCS)、生理指標(biāo)及有無嚴(yán)重器官系統(tǒng)功能不全及免疫損害等，將患者分為輕度30例，中51例，重度36例。收集同期在本院體檢的健康志愿者共78例作為對照組。對照組中男38例，女40例；年齡28～72歲，平均(60.31±10.37)歲。兩組受試者年齡(t=1.291，P=0.087)、性別構(gòu)成(χ2=0.123，P=0.726)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。兩組受試者均簽署知情同意書，且本研究經(jīng)本院倫理委員批準(zhǔn)。

1.2方法 采集受試者清晨空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min，立即采用Trizol試劑(Takara，日本)提取血清總RNA，通過分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的水平和純度，當(dāng)純度處于1.8～2.1時可進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗。取1 μg總RNA以Random Primer &Oligo DT為引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA(ribo SCRIPTTM Reverse Transcription kit，廣州瑞博生物技術(shù)有限公司)；采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測lncRNA THRIL表達(dá)，嚴(yán)格按照SYBR Green PCR試劑盒(ribo SCRIPTTM lncRNA qRT-PCR Starter Kit，廣州瑞博生物技術(shù)有限公司)說明書操作。引物序：lncRNA THRIL上游引物5’-AACTTCACAGGAACACTACACAAGA-3’，下游引物5’-TAGGCAACA GAGAGCAAGACTTCATC-3’；內(nèi)參為GAPDH，上游引物5’-GGCTAGTCGTAGCATCG-3’，下游引物5’-TGGCATGCCCGATCGATC-3’。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行40個循環(huán)，每次試驗設(shè)置5個復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCt計算lncRNA THRIL的相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1試驗組和對照組lncRNA THRIL表達(dá)差異 對lncRNA THRIL進(jìn)行正態(tài)性檢驗，兩組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性分布(P=0.200，0.051)。試驗組患者lncRNA THRIL的相對表達(dá)量為2.61±0.82，對照組的相對表達(dá)量為1.33±0.47，試驗組患者lncRNA THRIL相對表達(dá)量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-13.627，P<0.05)。

2.2lncRNA THRIL表達(dá)水平與膿毒癥患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 lncRNA THRIL表達(dá)水平與患者年齡、性別無關(guān)(P>0.05)，lncRNA THRIL在不同膿毒癥嚴(yán)重程度患者及由APACHEⅡ評分判斷不同嚴(yán)重程度患者中表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，膿毒性休克及APACHEⅡ評分判斷為重度的患者lncRNA THRIL表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)膿毒癥患者血清lncRNA THRIL表達(dá)水平

2.3ROC曲線評估lncRNA THRIL對膿毒癥患者預(yù)后的預(yù)測價值 試驗組膿毒癥患者中共43例死亡，74例生存，采用ROC曲線評估lncRNA THRIL對膿毒癥患者預(yù)后的預(yù)測價值，結(jié)果表明lncRNA THRIL可以作為膿毒癥患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物(P<0.001)。其預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后的曲線下面積(AUC)為0.839，95%CI為0.764～0.915，約登指數(shù)為0.692，靈敏度、特異度分別為87.8%、81.4%。見圖1。

圖1 lncRNA THRIL預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后的ROC曲線

3 討 論

lncRNA參與機(jī)體免疫反應(yīng)已被越來越多地揭示，其免疫調(diào)節(jié)作用也已在各種免疫細(xì)胞，如單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中得到證實(shí)[10]。此外，在調(diào)節(jié)型T細(xì)胞(Th)1、Th2和Th17的分化過程中，不同的lncRNA也表現(xiàn)出不同的作用，這進(jìn)一步說明了lncRNA與炎性反應(yīng)和炎癥因子表達(dá)密切相關(guān)[11-12]。LncRNA在膿毒癥中的作用也逐漸被報道，ZHAN等[13]通過盲腸結(jié)扎和穿刺建立膿毒性腦病大鼠模型，注射shRNA-LncRNA-5657治療大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后抑制了大鼠海馬神經(jīng)元變性和降低壞死水平，降低了水通道蛋白4(AQP4)、肝素酶(HPSE)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的免疫反應(yīng)性，并降低了TNF-α的水平。這些發(fā)現(xiàn)表明，lncRNA-5657的表達(dá)可以顯著減輕膿毒性腦病期間的炎性反應(yīng)，并誘導(dǎo)對該疾病的保護(hù)作用。袁超等[14]探討了lncRNA MEG3在膿毒癥患者中的表達(dá)情況及意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3在膿毒癥患者血漿中高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與膿毒癥的嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性，可以作為膿毒癥預(yù)后的預(yù)測因子。lncRNA與膿毒癥進(jìn)展的機(jī)制包括：作用miRNA的“分子海綿”，與miRNA形成分子海綿，進(jìn)一步影響炎癥細(xì)胞因子TNF-α、白細(xì)胞介素等的表達(dá)[6,14]；或通過細(xì)胞信號通路而影響炎癥因子水平[15-16]。

lncRNA THRIL通過調(diào)控TNF-α水平參與體內(nèi)的炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答，XU等[17]通過臨床試驗發(fā)現(xiàn)THRIL高表達(dá)與骨肉瘤組織和血清樣本中TNF-α水平升高有關(guān)。另外lncRNA THRIL過表達(dá)與心肌細(xì)胞損傷和心功能不全有關(guān)[18]。還有研究表明在膿毒癥小鼠模型中，抑制lncRNA THRIL可減少炎癥細(xì)胞數(shù)量和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[19]。本研究探討lncRNA THRIL在膿毒癥患者血清中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討其與膿毒癥嚴(yán)重程度的關(guān)系及對膿毒癥預(yù)后的預(yù)測價值。結(jié)果顯示，與對照者相比，lncRNA THRIL在膿毒癥患者血清高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與膿毒癥的嚴(yán)重程度有一定關(guān)系。lncRNA THRIL預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后的AUC為0.839，靈敏度、特異度分別為87.8%、81.4%。以上結(jié)果表明lncRNA THRIL與膿毒癥的嚴(yán)重程度有關(guān)，并對膿毒癥預(yù)后有一定預(yù)測價值。該結(jié)果與LIU等[20]的結(jié)果有一定的一致性，該研究者發(fā)現(xiàn)lncRNA THRIL在膿毒癥患者中表達(dá)上調(diào)，lncRNA THRIL的過表達(dá)導(dǎo)致TNF-α的水平增加是脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的增強(qiáng)劑。

綜上所述，lncRNA THRIL表達(dá)水平與膿毒癥的嚴(yán)重程度有一定關(guān)系，并且對于ICU膿毒癥患者的預(yù)后有一定預(yù)測價值，可進(jìn)一步在臨床中擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究，為膿毒癥的診斷、治療和預(yù)后提供更多的參考。