異型淋巴細(xì)胞、EB病毒及TLR7聯(lián)合檢測在兒童傳染性單核細(xì)胞增多癥中的診斷價值

林 珊,郭三平,江心怡,莫紅梅

深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗中心，廣東深圳 518000

傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)是常見急性傳染病，主要是由于EB病毒(EBV)感染造成的，兒童為高發(fā)人群，導(dǎo)致發(fā)熱、咽峽炎、淋巴結(jié)腫大等[1]。該病病程具有自限性，一般預(yù)后良好，但是其臨床表現(xiàn)變化多樣，且涉及多個系統(tǒng)，早期易誤診或漏診，若治療不及時易導(dǎo)致繼發(fā)其他惡性疾病或嚴(yán)重并發(fā)癥[2]。近年的免疫學(xué)研究顯示，EBV能逃避免疫系統(tǒng)識別，成功侵入B淋巴細(xì)胞，造成外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)及形態(tài)的改變，因此血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測對臨床診治IM具有重要意義[3]。隨著生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，EBV-DNA檢測也被用于IM的診斷，其負(fù)荷量能夠反映EBV復(fù)制水平，具有較高的特異性[4]。Toll樣受體(TLR)是一種模式識別受體，在EBV感染早期能夠識別病毒蛋白，在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮一定作用，TLR7還可識別單鏈RNA病毒，誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)或炎性反應(yīng)[5]。基于此，本研究對IM患兒外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果、TLR7 mRNA及EBV-DNA水平進(jìn)行分析，探討3項指標(biāo)聯(lián)合檢測在IM中的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2020年1月至2021年10月來本院就診的IM患兒119例作為IM組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合IM診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)均為初診病例；(3)能配合研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有惡性腫瘤患兒；(2)患有嚴(yán)重血液疾病患兒；(3)伴有嚴(yán)重心、肺、肝功能障礙患兒；(4)存在精神疾病患兒；(5)存在免疫缺陷患兒；(6)發(fā)育遲緩或先天畸形患兒。選擇同期來本院體檢的健康兒童50例作為對照組。兩組患兒的一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意，所有研究對象家屬均知情同意。

表1 兩組患兒一般資料比較(n/n或

1.2方法

1.2.1外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測 所有受試者入院時采集外周靜脈血2 mL，采用EDTA-K2抗凝，進(jìn)行血涂片，瑞氏-姬薩姆染液(珠海貝索公司)染色，待血片自然干燥后，油鏡鏡檢。由具備血液細(xì)胞學(xué)檢測資質(zhì)的檢驗師進(jìn)行閱片，觀察血細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)行淋巴細(xì)胞計數(shù)，并在顯微鏡下計數(shù)100個白細(xì)胞，得到異型淋巴細(xì)胞比值。陽性標(biāo)準(zhǔn)：異型淋巴細(xì)胞比值>10%。

1.2.2外周血EBV-DNA載量檢測 所有受試者入院時采集外周靜脈血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)儀檢測EBV-DNA載量。PCR擴(kuò)增條件：50 ℃靜止2 min，1個循環(huán)(進(jìn)行UNG酶反應(yīng))；94 ℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)(進(jìn)行Tap酶活化)；再94 ℃變性15 s，57 ℃變性31 s，共10個循環(huán)，最后94 ℃變性30 s；55 ℃變性45 s，共30個循環(huán)。按照試劑盒說明書，以≥1×103copy/mL為陽性。

1.2.3TLR7 mRNA檢測 所有受試者入院時采集外周靜脈全血2 mL，常規(guī)抗凝后，將外周血單個核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行分離備用。采用RT-qPCR進(jìn)行TLR7 mRNA檢測。采用Trizol試劑盒提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR引物序列：正向，5′-ATTGTGAAGTCCAGACTCTTTGTC-3′；反向，5′-CCTGCTGCCAGTGGCTGACCAGT-3′。體系為20.0 μL：10.0 μL TaqⅡ qPCR，0.4 μL 10 μmol/L PCR上游引物，0.4 μL 10 μmol/L PCR下游引物，2.0 μL cDNA模板和7.2 μL去酶水。RT-qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性20 s，52 ℃退火10 s，72 ℃延伸2 min，共36個循環(huán)。TLR7 mRNA表達(dá)水平以2-ΔΔCt方法計算。

1.3觀察指標(biāo) (1)收集所有受試者的一般資料；(2)比較IM組與對照組的外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果、TLR7 mRNA表達(dá)水平及EBV-DNA載量；(3)比較IM組中不同EBV-DNA載量患兒的外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果及TLR7 mRNA表達(dá)水平；(4)分析外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果、TLR7 mRNA表達(dá)水平與EBV-DNA載量的相關(guān)性；(5)分析異型淋巴細(xì)胞比值、TLR7 mRNA表達(dá)水平及EBV-DNA載量對IM的診斷價值。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA表達(dá)水平比較 IM組的淋巴細(xì)胞計數(shù)、異型淋巴細(xì)胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA表達(dá)水平比較

2.2IM組中不同EBV-DNA載量患兒的外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果及TLR7 mRNA表達(dá)水平比較 以IM組患兒的EBV-DNA中位水平7.18×103copy/mL為界值，將≥7.18×103copy/mL的患兒納入高載量組(60例)，<7.18×103copy/mL的患兒納入低載量組(59例)。兩組淋巴細(xì)胞計數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高載量組的異型淋巴細(xì)胞比值及TLR7 mRNA表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 IM組中不同EBV-DNA載量患兒的外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果及TLR7 mRNA表達(dá)水平比較

2.3外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果、TLR7 mRNA表達(dá)水平與EBV-DNA載量的相關(guān)性 淋巴細(xì)胞計數(shù)與EBV-DNA載量無明顯相關(guān)性(P>0.05)，異型淋巴細(xì)胞比值及TLR7 mRNA表達(dá)水平與EBV-DNA載量呈正相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果、TLR7 mRNA表達(dá)水平與EBV-DNA載量的相關(guān)性

2.4異型淋巴細(xì)胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA對IM的診斷價值 ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，3項指標(biāo)聯(lián)合診斷IM的曲線下面積(AUC)為0.952，高于單一的異型淋巴細(xì)胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA的AUC(0.863、0.878、0.792)，見圖1、表5。

圖1 異型淋巴細(xì)胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA診斷IM的ROC曲線

表5 異型淋巴細(xì)胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA診斷IM的效能分析

3 討 論

IM是由EBV感染引起的急性增生性傳染病，傳播途徑為唾液及血液。EBV感染可引起全身性免疫異常，累及多個器官，同時還能逃避機(jī)體的免疫反應(yīng)，在人體淋巴組織中潛伏，使患者長期攜帶病毒[7-8]。研究表明我國IM多見于兒童，小于12歲兒童的發(fā)病率可達(dá)60%，多數(shù)患兒起病時癥狀輕微，無特異性臨床表現(xiàn)，在臨床診斷中極易出現(xiàn)漏診或誤診情況，而治療不及時可能引起其他嚴(yán)重并發(fā)癥，進(jìn)而威脅患兒生命，因此早期的準(zhǔn)確診斷十分關(guān)鍵[9]。而目前的診斷方式仍是以實驗室檢查為主，但每種檢查方法都有方法學(xué)的限制，聯(lián)合檢查是如今臨床對疾病進(jìn)行診斷的發(fā)展趨勢。

研究表明當(dāng)EBV入侵人體時，B淋巴細(xì)胞受體會與其結(jié)合，隨后病毒增殖、復(fù)制，進(jìn)一步激活抑制性T淋巴細(xì)胞的增殖、自身轉(zhuǎn)化，由于細(xì)胞毒性效應(yīng)，使異常增殖的T淋巴細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變，形成異型淋巴細(xì)胞，該類細(xì)胞一般分為幼稚型、不規(guī)則型、空泡型3種形態(tài)[10-11]。外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測具有臨床實用性，有報道指出EBV感染患兒外周血異型淋巴細(xì)胞計數(shù)明顯升高[12]。本研究中，IM組的淋巴細(xì)胞計數(shù)、異型淋巴細(xì)胞比值均高于對照組，這與前人研究具有一致性[12]。研究表明，異型淋巴細(xì)胞普遍出現(xiàn)在IM發(fā)病后3 d，于第1周漸漸加多，其比值能夠達(dá)10%，在第2～3周最多可達(dá)40%，因此外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測有利于IM早期診斷[13]。還有研究認(rèn)為異型淋巴細(xì)胞在其他疾病，如腺病毒、肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒等導(dǎo)致的感染性疾病中也存在增多現(xiàn)象，因此還需聯(lián)合其他手段輔助IM的診斷[14]。

近年來RT-qPCR檢測EBV-DNA成為檢測EBV感染的重要手段，該方式能夠有效擴(kuò)增，并對每個循環(huán)中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行實時監(jiān)測，可以將病毒的拷貝數(shù)準(zhǔn)確檢測出來，并能反映EBV感染，具有較高的特異性及準(zhǔn)確性，且重復(fù)性好、操作簡便[15]。黃璐[16]研究表明EBV-DNA載量在診斷IM中具有較高臨床應(yīng)用價值。本研究中，IM組的EBV-DNA載量高于對照組，提示IM患兒感染后，EBV-DNA水平顯著升高。研究表明，對于臨床癥狀不典型、血清學(xué)不能診斷的疑似IM患兒進(jìn)行EBV-DNA檢測，能夠?qū)Πl(fā)熱初期的IM患兒早期診斷，避免抗菌藥物的濫用及并發(fā)癥的發(fā)生[17]。同時本研究發(fā)現(xiàn)，高載量組的異型淋巴細(xì)胞比值高于低載量組，異型淋巴細(xì)胞比值與EBV-DNA載量呈正相關(guān)，這提示患兒體內(nèi)EBV-DNA載量與異型淋巴細(xì)胞比值有關(guān)。研究表明，EBV-DNA載量與IM患兒病情嚴(yán)重程度有關(guān)，其水平能夠反映病毒復(fù)制能力及患兒免疫清除能力，病毒載量越高，患兒病情越嚴(yán)重，機(jī)體免疫功能越差，異型淋巴細(xì)胞比值也顯著升高[18]。

研究表明EBV感染與患兒免疫功能有很大關(guān)系，而TLR7在固有免疫和適應(yīng)性免疫中起著重要的橋梁作用[19]。IM組TLR7 mRNA表達(dá)水平高于對照組，高載量組的TLR7 mRNA表達(dá)水平高于低載量組，提示EBV感染能升高TLR7 mRNA表達(dá)水平。研究表明髓樣樹突狀細(xì)胞可通過TLR7識別EBV衍生的單鏈RNA，然后募集下游信號、分子，刺激初始T淋巴細(xì)胞分化成特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞等，從而發(fā)揮抗病毒作用[20]。本研究ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，異型淋巴細(xì)胞比值、EBV-DNA載量及TLRI mRNA聯(lián)合診斷IM時的AUC為0.952，高于單一的異型淋巴細(xì)胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA的0.863、0.878、0.792，提示3項指標(biāo)聯(lián)合診斷IM的效能更佳。吳菲等[21]研究表明EBV衣殼蛋白(EBV-CA)IgM抗體、EBV-DNA及外周血異型淋巴細(xì)胞比值聯(lián)合檢測診斷兒童IM能顯著提高特異度，有助于降低誤診率，這與本研究結(jié)果類似。當(dāng)然本研究也存在一些不足，本研究為回顧性研究，研究對象的選擇容易產(chǎn)生誤差和偏倚，且本研究樣本量較少，今后將聯(lián)合多中心，擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行前瞻性研究。

綜上所述，IM患兒的淋巴細(xì)胞計數(shù)、異型淋巴細(xì)胞比值、EBV-DNA載量及TLR7 mRNA表達(dá)水平均高于健康兒童，異型淋巴細(xì)胞比值、TLR7 mRNA表達(dá)水平均與EBV-DNA載量有一定關(guān)系，3項指標(biāo)聯(lián)合檢測能提高診斷IM的效能。