解熱顆粒質(zhì)量標準研究*

翟巧利，麥格皮熱提·阿不力米提，李 媛，劉 娟，范 偉，時扣榮△

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院，上海 200137；2.新疆維吾爾自治區(qū)莎車縣維吾爾醫(yī)醫(yī)院，新疆 喀什 844700）

解熱方為上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院老中醫(yī)唐英的臨床經(jīng)驗方，以疏風清熱解毒為法遣藥組方，由鴨跖草、大青葉、四季青、荊芥、紫蘇葉5味中藥材組方。方中，鴨跖草為君藥，味甘，性寒，有清熱解毒、利水消腫的功效。大青葉為臣藥，味苦，性寒，有清熱解毒、涼血消斑的功效。四季青味苦，性涼，有清熱解毒、消腫祛瘀的功效；荊芥性平溫，有疏風解表、透疹消瘡的功效，共為佐藥。紫蘇葉為使藥，味辛，性溫，有解表、散寒、行氣、和胃的功效。諸藥合用，共奏疏風解表、清熱解毒功效，用于治療屬外感風熱表證的上呼吸道感染。全方組方嚴密，君臣佐使配伍合理，藥味簡練，功效專著，臨床療效明顯。解熱方的臨床使用劑型為湯劑，存在口感欠佳、保質(zhì)期短、不便貯存和運輸?shù)热秉c。應用現(xiàn)代化技術將湯劑優(yōu)化為顆粒劑，可更好地發(fā)揮療效，方便患者服用及攜帶。本研究中建立了解熱顆粒的質(zhì)量標準，采用薄層色譜（TLC）法對制劑中大青葉和四季青進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中長梗冬青苷的含量。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配有蒸發(fā)光散射檢測器；BSA124S型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為萬分之一）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為50 kHz）；聚酰胺薄膜（國藥集團化學試劑有限公司）；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠）；DHG-9055A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

長梗冬青苷對照品（批號為111868-201202），靛藍對照品（批號為110716-201612），靛玉紅對照品（批號為110717-200204），均購于中國食品藥品檢定研究院，含量均不低于98%；解熱顆粒（醫(yī)院制劑，滬藥制備字Z20210046000，批號分別為201001，201002，201003）；缺大青葉、四季青陰性樣品均由上海萬仕誠藥業(yè)有限公司制劑室自制；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水；鴨跖草（批號為20200526-1），大青葉（批號為20200710-1），四季青（批號為191123-1），荊芥（批號為20200714-1），紫蘇葉（批號為20200804-1），均購于上海萬仕誠藥業(yè)有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院藥學部副主任中藥師公丕君鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

大青葉［1-3］：取樣品適量，研細，取5 g，加三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取靛藍對照品和靛玉紅對照品，加三氯甲烷制成每1 mL各含1 mg的混合對照品溶液。按解熱顆粒制備工藝制備不含大青葉的陰性樣品，依法制備缺大青葉的陰性對照品溶液。照2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干。供試品溶液色譜中，在與靛藍和靛玉紅混合對照品溶液色譜相應位置分別顯相同的藍色斑點和淺紫紅色斑點，斑點清晰，分離效果較好，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 A。

四季青［4］：取樣品適量，研細，取5 g，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取長梗冬青苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。按解熱顆粒制備工藝制備不含四季青的陰性樣品，依法制備缺四季青的陰性對照品溶液。照2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗，吸取上述3種溶液各4μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（7∶1∶0.2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與長梗冬青苷對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，斑點清晰，分離效果較好，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 B。

1.陰性對照品溶液（缺大青葉、四季青）2.對照品溶液（靛藍和靛玉紅、長梗冬青苷）3-5.供試品溶液（批號分別為201001，201002，201003）A.大青葉B.四季青圖1薄層色譜圖1.Negative reference solution（lacking Isatidis Folium and Ilicis Chinensis Folium，respectively）2.Reference solution（indigo and indirubin，pedunculoside，respectively）3-5.Test solution（batch number：201001，201002 and 201003）A.Isatidis Folium B.Ilicis Chinensis FoliumFig.1 TLC chromatograms

2.2 含量測定［4-5］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：10%異丙醇甲醇（A）-10%異丙醇水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL和20 μL（對照品溶液），10 μL（供試品溶液）。理論板數(shù)按長梗冬青苷峰計不得低于2 000。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Program of gradient elution of mobile phase（%）

2.2.2 溶液制備

取長梗冬青苷對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 mL含0.3 μg的對照品溶液。取樣品適量，研細，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得試品溶液。按解熱顆粒處方和制備工藝制備缺四季青的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備缺四季青的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別吸取2.2.2項下3種溶液各適量，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果陰性對照品溶液色譜圖中，在與長梗冬青苷對照品溶液相同保留時間處無干擾峰，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

1.長梗冬青苷A.供試品溶液B，B'.對照品溶液（進樣量分別為10 μL和20 μL）C.陰性對照品溶液圖2高效液相色譜圖1.PedunculosideA.Test solution B，B'.Reference solution（injection volumes of 10 μL and 20 μL，respectively）C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.2.2項下長梗冬青苷對照品溶液4，8，12，16，20μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，以長梗冬青苷對照品進樣量（X，μL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程logY=1.582 7 logX+2.149 4（r=0.999 7，n=5）。結果表明，長梗冬青苷的進樣量在0.715 4～3.557 5 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2.2項下長梗冬青苷對照品溶液適量，按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果長梗冬青苷平均峰面積為337.40，RSD為1.40%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2.2項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，12，24，48 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果放置0，12，24，48 h時長梗冬青苷的含量分別為0.901 1%，0.913 2%，0.919 5%，0.905 2%，放置12，24，48 h時的RSD分別為0.90%，1.40%，0.30%，表明供試品溶液在室溫放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取同一批（批號為201001）樣品適量，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果樣品中長梗冬青苷的平均含量為9.01 mg/g，RSD為1.40%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批（批號為201001）樣品適量，精密稱定，共6份，精密加入質(zhì)量濃度為0.181 1 mg/mL的長梗冬青苷對照品溶液15 mL，揮干溶劑，依法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批（批號分別為201001，201002，201003）樣品各適量，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項下色譜條件進樣測定2次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果3批樣品中長梗冬青苷的含量分別為7.90，7.60，7.40 mg/g。

3 討論

3.1 TLC鑒別

本研究中參考2020年版《中國藥典（四部）》［4］和文獻［1-3］，采用TLC法對制劑中大青葉和四季青進行定性鑒別，分別選用有效成分靛藍和靛玉紅、長梗冬青苷作為對照。結果顯示，大青葉和四季青的TLC分離效果較好，斑點顯色清晰，可有效進行鑒別。同時，參考文獻［6-8］對方中鴨跖草、荊芥和紫蘇葉進行了TLC鑒別，發(fā)現(xiàn)這3味中藥材的分離效果較差，且斑點不清晰，故暫未列入質(zhì)量標準，有待進一步研究。

3.2 含量測定

長梗冬青苷是四季青的主要有效成分，屬五環(huán)三萜類化合物［9］，是四季青的指標性成分［4］。本研究中建立了測定解熱顆粒中長梗冬青苷含量的HPLC法，并進行了方法學考察。結果顯示，長梗冬青苷色譜峰的峰形良好，且分離度佳，各組分互不干擾，表明含量測定方法簡便，結果可靠。同時，對方中君藥鴨跖草和臣藥大青葉也進行了含量測定，結果發(fā)現(xiàn)峰形不佳，且分離效果較差，故暫未列入質(zhì)量標準，有待進一步研究。

3.3 方法評價

所建立的方法操作簡便、專屬性強、準確度高、重復性好，可用于解熱顆粒的質(zhì)量控制。