光譜滴定法測(cè)定蜂蜜酸度的應(yīng)用研究

關(guān)朝亮，呂萍萍，汪海波，宋喜臣，王宗瑩，何浩，桑琳，張玥，李佳琪，王飛

（1 綏芬河海關(guān)綜合技術(shù)中心，綏芬河 157399；2 秦皇島海關(guān)技術(shù)中心，秦皇島 066000）

1 引言

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)。它有很好的保健效果及藥用價(jià)值，具有抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖、預(yù)防齲齒、促進(jìn)酒精代謝、緩解感冒癥狀、潤(rùn)腸通便、調(diào)節(jié)血壓等諸多功效[1]。現(xiàn)在市場(chǎng)上蜂蜜種類(lèi)繁多，品質(zhì)優(yōu)劣不等，而酸度是衡量蜂蜜及其制品是否變質(zhì)的重要指標(biāo)之一[2]。

目前對(duì)蜂蜜中酸度的測(cè)定主要有兩種方法，分別為電位滴定法[3]和酸堿指示劑滴定法[4]。電位滴定法是用酸度計(jì)測(cè)定終點(diǎn)，有較高的準(zhǔn)確度和精密度，避免溶液顏色干擾，但低濃度溶液測(cè)量準(zhǔn)確性不好。酸堿指示劑滴定法屬人工感官滴定，一般用酚酞作為指示劑，要用人眼對(duì)顏色變化進(jìn)行判斷滴定終點(diǎn)，存在難以統(tǒng)一變色評(píng)價(jià)條件、個(gè)人對(duì)終點(diǎn)變色的文字描述理解不同、無(wú)法量值溯源終點(diǎn)顏色等問(wèn)題，會(huì)給結(jié)果判定帶來(lái)諸多問(wèn)題，所以也對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)有著較高要求，容易產(chǎn)生誤差。

可見(jiàn)光光譜滴定技術(shù)（Visible Spectral Titration Technology,VSTT）是新發(fā)明技術(shù)，有效實(shí)現(xiàn)了滴定過(guò)程中的顏色數(shù)值化、圖形化技術(shù)，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生的光譜變化進(jìn)行物質(zhì)結(jié)構(gòu)表征，同時(shí)對(duì)滴定參數(shù)同步記錄，實(shí)現(xiàn)滴定終點(diǎn)的量值溯源，避免顏色變化不明顯、不同人員檢測(cè)等因素所產(chǎn)生的顏色判斷誤差，給出更低的檢出限[6]。VSTT 在蜂蜜中酸度的測(cè)定應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道，本文對(duì)蜂蜜中酸度含量進(jìn)行了研究。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 測(cè)試樣品

俄羅斯進(jìn)口椴樹(shù)蜜及向日葵蜜。

2.2 儀器與試劑

SX-Z-3.3 光譜滴定儀（秦皇島水熊科技有限公司）；XP205 電子天平（瑞士梅特勒公司）；水浴鍋（北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司）；德國(guó)賓德恒溫干燥箱M53；25mL 堿式滴定管等。

氫氧化鈉（優(yōu)級(jí)純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），鄰苯二甲酸氫鉀基準(zhǔn)試劑（99.95%～100.05%，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司），酚酞（99.3%，偉業(yè)計(jì)量）。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 樣品的制備

未結(jié)晶的樣品攪拌均勻，有結(jié)晶析出的樣品，將樣品瓶蓋塞緊后，置于不超過(guò)60℃的水浴中溫?zé)幔龢悠啡咳芑螅瑪噭颍杆倮鋮s至室溫以備檢驗(yàn)用。

2.3.2 溶液的制備

0.01mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照 GB/T 601 配制0.1 mol/L 并標(biāo)定，臨用時(shí)，用無(wú)二氧化碳的水稀釋至0.01 mol/L[5]。

酚酞指示劑（1%乙醇溶液）：稱(chēng)取1 g 酚酞用95%乙醇定容至100 mL，混合均勻[4]。

2.3.3 酸度的光譜滴定原理

滴定過(guò)程中的不同離子成分的改變引起被測(cè)物結(jié)構(gòu)的改變，同步使吸收光譜發(fā)生變化（顏色變化），該變化點(diǎn)為國(guó)標(biāo)的滴定終點(diǎn)。VSTT[6]用色變曲線(xiàn)參數(shù)同步描述顏色變化軌跡，用數(shù)字化、圖形化的曲線(xiàn)標(biāo)識(shí)顏色變化過(guò)程，曲線(xiàn)上的突變峰與吸收光譜有對(duì)應(yīng)關(guān)系 。

2.3.4 光譜滴定儀條件

光譜范圍380 nm～780 nm，△λ5 nm，測(cè)量周期100 ms，積分時(shí)間100 ms，光程10.0 mm，滴定速率0.167 mL/min，攪拌速度300 轉(zhuǎn)/min，靴型反應(yīng)器180 mL。

2.3.5 光譜滴定方法[4]

在反應(yīng)器中依次加入75 mL 經(jīng)煮沸后冷卻的水、試樣10g（精確至0.001g），溶解后加入2 滴～3 滴酚酞指示劑，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)。按式（1）計(jì)算式樣的酸度：

式中：X—試樣的酸度，單位為毫升每千克（mL/kg）（消耗1mol/L 氫氧化鈉）V—依據(jù)圖譜確認(rèn)的滴定終點(diǎn)時(shí)所耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為毫升（mL）；c—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，單位為摩爾每升（mol/L）；m—試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。

2.3.6 感官滴定方法[4]

在燒杯中加入試樣10 g，以75 mL 經(jīng)煮沸后冷卻的水溶解后，加入2～3 滴酚酞指示劑，用氫化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈粉紅色，在10 秒內(nèi)不褪色為終點(diǎn)。代入公式（1）計(jì)算。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 22.0 軟件對(duì)兩種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)分析，推論出差異發(fā)生的概率P 值（即sig 值），比較兩種方法有無(wú)差異，驗(yàn)證所得結(jié)論的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蜂蜜酸度的光譜滴定終點(diǎn)確認(rèn)

酸度的光譜滴定過(guò)程中，CIE1976(L*a*b*)均勻彩色空間參數(shù)值的明度指數(shù)L*值、紅-綠色品指數(shù)a*值、黃-藍(lán)色品指數(shù)b*值，均發(fā)生了相應(yīng)改變，滴定終點(diǎn)時(shí)各數(shù)值變化明顯減小，變化軌跡。

圖1—圖3 表明，L*值在x 軸上方，在滴定體積約1.7mL 后開(kāi)始下降，說(shuō)明溶液明度在降低；L*值曲線(xiàn)整體看不平滑，有個(gè)別干擾峰，可能是在滴定過(guò)程中溶液波動(dòng)從而影響了透光度。a*值在滴定體積約1.6mL 后明顯增大，一直處于x 軸上方，說(shuō)明溶液顏色由無(wú)色向紅色轉(zhuǎn)變，并越來(lái)越深。b*值在滴定體積約1.6mL 后開(kāi)始下降，在約2.3mL 由x 軸上方下降至x 軸下方，說(shuō)明溶液顏色由很淡的黃色漸變?yōu)楹艿乃{(lán)色。試驗(yàn)溶液變化為混合色，即溶液由帶著很淡的黃色至幾近于無(wú)色轉(zhuǎn)變紅色。光譜滴定顏色的測(cè)定數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)感官滴定人工判斷顏色的變化相符。

圖1 酸度的光譜滴定CIE1976(L＊a＊b＊)曲線(xiàn)V-L＊

圖2 酸度的光譜滴定CIE1976(L＊a＊b＊)曲線(xiàn) V-a＊b＊

圖3 CIE 1976(L＊a＊b＊)彩色均勻空間示意圖[7]

本文采用VSTT 的參數(shù)G 峰值做為滴定終點(diǎn)[6]，更接近a*值和b*值的共同變色終點(diǎn)。以加入的滴定劑的體積（V）作為橫坐標(biāo)，以VSTT 終點(diǎn)參數(shù)G 作為縱坐標(biāo)，繪制G-V 滴定曲線(xiàn)，曲線(xiàn)上的最大峰值即為滴定終點(diǎn)，如圖4 所示。

圖4 光譜滴定CIE1976(L＊a＊b＊)曲線(xiàn)G-V

3.2 光譜滴定法測(cè)定酸度的檢出限

本次重復(fù)測(cè)定10 次空白試驗(yàn)[7]，結(jié)果按公式（1）計(jì)算為樣品中的酸度含量，結(jié)果見(jiàn)表1，并按公式（2）計(jì)算方法檢出限。

表1 光譜滴定法測(cè)定酸度含量的檢出限（n=10）

式中：MDL-方法檢出限；n-樣品的平行測(cè)定次數(shù)；t-自由度為n -1，置信度為99%時(shí)的t分布值（單側(cè)）；S-n 次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差[7]。

本次測(cè)定t(10，0.99)值為2.821，以此計(jì)算本方法的檢出限為0.10 mL/kg，最大差異值為0.12，在允許的差異范圍0.18±0.05 之內(nèi)，符合HJ 168-2020 標(biāo)準(zhǔn)中“檢出限可允許的差異范圍應(yīng)在‘空白試驗(yàn)測(cè)定值的均值估計(jì)檢出限的1/2’以?xún)?nèi)”的要求[7]。此檢出限的測(cè)定，彌補(bǔ)了感官滴定法沒(méi)有檢出限的缺陷。

3.3 樣品的測(cè)定結(jié)果比對(duì)

在相同的前處理?xiàng)l件下，利用感官滴定法和光譜滴定法測(cè)定樣品的酸度，同時(shí)進(jìn)行樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)，驗(yàn)證兩種方法的可靠性，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2、表3。

表2 樣品中酸度的測(cè)定結(jié)果及 t 檢驗(yàn)

表3 回收率的測(cè)定結(jié)果

由表2、表3 可知，兩種方法測(cè)定樣品中酸度結(jié)果的精密度均符合SN/T 0852-2012 要求（平行試驗(yàn)結(jié)果的允許誤差為0.1）[4]；兩種方法測(cè)定樣品中酸度結(jié)果均無(wú)顯著差異(P＞0.05)；感官滴定法的加標(biāo)回收率為 94.8%～98.1%，光譜滴定法的加標(biāo)回收率為94.3%～97.9%，符合GB/T 27404-2008 中技術(shù)要求（被測(cè)組分含量1～100 mg/kg 時(shí)，回收率范圍90%～110%）[8]，表明兩種方法均準(zhǔn)確、可靠。

4 結(jié)論

可見(jiàn)光光譜滴定技術(shù)（VSTT）是由我國(guó)學(xué)者首次提出的滴定分析理論，測(cè)量可見(jiàn)光全譜同步吸收變化，用光譜滴定曲線(xiàn)的凸變峰標(biāo)示滴定終點(diǎn)的突躍，實(shí)現(xiàn)了有色滴定分析的自動(dòng)化、數(shù)字化，是滴定分析領(lǐng)域的新突破。目前，光譜滴定法的應(yīng)用研究還處于空白狀態(tài)，本文首次利用光譜滴定法測(cè)定蜂蜜中酸度，通過(guò)精密度、準(zhǔn)確性、檢出限等指標(biāo)驗(yàn)證了方法的可行性，證明了光譜滴定可代替感官滴定的可操作性，為VSTT 的應(yīng)用研究提供了有價(jià)值的參考，進(jìn)一步發(fā)展VSTT 或?qū)⒊蔀榻鉀Q化學(xué)研究、檢驗(yàn)檢測(cè)等行業(yè)問(wèn)題的新的技術(shù)手段。