蜜蜂遺傳育種新技術（四）
——基因芯片主要技術流程與應用

薛運波│文

基因芯片又叫DNA 芯片、DNA 微陣列，是在DNA 雜交技術的基礎上發展起來的、高通量的基因克隆與雜交信號間一對一的對應識別技術。它是將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段有序地、高密度地排列固定于介質載體上，以待測的核酸分子樣品為探針，經過熒光、生物素等發光信號元素或基團的標記，與固定在載體上的DNA 陣列中的點按照堿基配對原理同時進行雜交。通過激光共聚焦熒光檢測系統等對芯片加以掃描，檢測雜交信號強度（圖1），獲取樣品分子的數量和序列信息，再用計算機軟件處理分析數據，從而對基因序列及功能進行大規模、高通量的研究。

圖1 核酸雜交設備（薛運波 李興安 攝）

1.基因芯片主要技術流程

基因芯片技術的主要流程包括芯片的設計與制備、靶基因的標記、芯片的雜交與信號檢測。基因芯片的設計是指芯片上核酸探針序列的選擇以及排布，設計方法取決于其應用目的。目前的應用范圍主要包括基因表達和轉錄圖譜分析及靶序列中單堿基多態位點（SNPs）或突變點的檢測。

基因芯片的制備方法主要包括點樣法和原位合成法兩種類型：

（1）點樣法：首先是探針庫的制備，根據基因芯片的分析目標，從相關基因數據庫中選取特異的序列，進行PCR 擴增或直接人工合成寡核苷酸序列，然后通過計算機控制的三坐標工作平臺，用特殊的針頭和微噴頭，分別把不同的探針溶液逐點分配在玻璃、尼龍等載體表面的不同位點上，采用物理的和化學的方法使之固定。

（2）原位合成法：在玻璃等硬質載體表面上直接合成寡核苷酸探針陣列（圖2）。主要有光去保護并行合成法、壓電打印合成法等，其關鍵是高空間分辨率的模板定位技術和高合成產率的DNA 化學合成技術，適合制作大規模DNA 探針芯片，實現高密度芯片的標準化和規模化生產。

圖2 核酸純化設備（薛運波 李興安 攝）

樣品的制備是基因芯片實驗流程的一個重要環節。靶基因在與芯片探針雜交之前必須進行分離、擴增與標記。標記的方法根據樣品來源、芯片類型和研究目的的不同而有所差異。通常是在待測樣品的PCR擴增、逆轉錄或體外轉錄過程中實現對靶基因的標記。

基因芯片與靶基因的雜交過程，與一般分子雜交的過程基本相同。雜交反應的條件，要根據探針的長度、G+C 含量及芯片類型確定。用于基因表達檢測的芯片雜交嚴格性較低，而用于突變檢測的芯片雜交條件相對嚴格。如果是用同位素標記靶基因，其后的信號檢測即是放射自顯影。若用熒光標記，則需要一套熒光掃描及分析系統作為設備支持。

2.基因芯片的應用

目前，基因芯片被廣泛應用于基因表達圖譜的繪制。近年來，隨著基因芯片技術的發展和成熟，已經成功構建了一些昆蟲抗性相關基因芯片，并投入對昆蟲抗藥性的研究（圖3）。Shen 等構建了淡色庫蚊的細胞色素P450 基因芯片，對24 個CYP4 家族基因在淡色庫蚊抗性和敏感品系中的差異表達進行檢測。Le Goff 等也構建了一個黑腹果蠅的細胞色素P450 基因芯片，對抗不同殺蟲劑的果蠅的基因表達變化進行研究。Wu 等和David 等也都構建了不同的基因芯片，并對淡色庫蚊和岡比亞按蚊的抗藥性進行研究。這些基因芯片在昆蟲抗藥性研究中的應用，為了進一步揭示昆蟲對殺蟲劑的抗性機制，系統地理解不同的抗性相關基因之間的聯系及其相互作用提供理論依據。美國伊利諾伊州大學Charlse 等人研究內勤蜂和外勤蜂：他們用含有大約5500 個基因的DNA芯片檢測這兩種蜜蜂的大腦組織提取物。結果發現，內勤蜂與外勤蜂之間的基因表達是不相同的，而不同的內勤蜂或不同的外勤蜂之間，其基因表達則非常相似。研究表明，基因和行為之間的聯系程度比以前所認識到的更加密切。該研究結果將有助于發現開啟特定行為的主要基因。

圖3 核酸質譜設備（薛運波 李興安 攝）

基因芯片技術的發展勢頭十分迅猛，在基因表達譜分析、基因診斷、藥物篩選及序列分析等諸多領域已得到廣泛地應用，取得大量的數據和研究結果，呈現出廣闊的研究、開發與應用前景。但是該方法也存在不足之處，首先是基因芯片檢測技術成本高，其次，該技術只能從基因突變和基因表達差異方面給予檢測結果，尚不能根據分子檢測結果對生物體的表型和功能做出整體評估。雖然基因芯片技術還存在一些不足，但是隨著研究的不斷深入和技術的不斷完善，基因芯片一定會在蜜蜂科學研究領域發揮越來越重要的作用。