門靜脈成纖維細胞有望成為可再生肌成纖維細胞的新來源

馬鴻倩 鄢和新

作者單位：200127 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院麻醉科

多種肝臟疾病如慢性肝炎和膽汁淤積性肝損傷都會通過纖維化途徑導致肝硬化，但不同肝損傷最初表現(xiàn)出的纖維化模式不盡相同。例如，在膽汁淤積性疾病如原發(fā)性膽管炎和原發(fā)性硬化性膽管炎中，纖維化起初僅分布在門靜脈周圍，而酒精相關性肝病顯示纖維物質沉積在中心靜脈和肝竇周圍[1]。這些不同的纖維化模式表明，發(fā)生在不同位置的細胞特異性損傷可能與表型獨特的成纖維細胞相互作用，啟動不同的信號通路。

肝臟間充質細胞由位于肝竇的HSCs和血管周圍細胞組成，包括門靜脈和中央靜脈周圍的血管平滑肌細胞和成纖維細胞。這些間充質細胞來源于胚胎橫隔間充質(STM)[2]，STM誘導腹側前腸內(nèi)胚層擴張形成肝芽。原始肝細胞長入間充質，形成肝竇狀結構；位于肝細胞和肝竇內(nèi)皮細胞之間的間充質細胞最終將發(fā)育成HSCs[3]。貫穿于發(fā)育中的肝芽靜脈分支，即新生的門靜脈系統(tǒng)，通過導管板的形態(tài)發(fā)生，驅動肝母細胞分化形成膽管細胞。肝內(nèi)動脈分支沿著新生的肝內(nèi)膽管分支，從發(fā)育中的肝臟中央?yún)^(qū)域延伸到周圍區(qū)域，嵌入肝臟間充質，形成由門靜脈、肝動脈和總膽管組成的門靜脈三聯(lián)體。

在過去的30年里，HSCs因具有向肌成纖維細胞分化的能力而被廣泛研究。HSCs是一種處于靜息狀態(tài)的、富含維生素A的間充質細胞，是第一個被鑒定為肝損傷時肌成纖維細胞來源的細胞[4]。隨著HSC分離技術的改進，許多研究確定了HSCs是肝纖維化中肌成纖維細胞的主要來源。最近的一項研究根據(jù)HSCs在肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展不同階段的作用將其分為兩類亞群，即靜止的、產(chǎn)生細胞因子的HSC(cyHSCs)和激活的肌成纖維細胞(myHSCs)。cyHSCs通過產(chǎn)生肝細胞生長因子HGF保護肝細胞免于死亡，在肝細胞癌初期抑制腫瘤發(fā)展；myHSC通過產(chǎn)生Ⅰ型膠原蛋白形成纖維化微環(huán)境，在肝細胞癌后期促進腫瘤發(fā)展[5]。

越來越多的證據(jù)表明，其他肝臟間充質細胞(尤其是門靜脈間充質細胞)也可以生成肌成纖維細胞，這些細胞受到了越來越多的關注[6-9]。事實上，早在幾十年前Schaffner等[10]就發(fā)現(xiàn)了位于肝竇以外的肝間充質細胞，使人們認識到肝成纖維細胞空間分布的特異性。門靜脈成纖維細胞(PFs)的空間定位使它們成為膽管纖維化的介質，2002年Kinnman和Housset[11]首次提出PFs是膽道纖維化的第一反應者，隨后被肝星狀細胞(HSCs)取代。此外，十多年前Dranoff和Wells[12]系統(tǒng)地討論了PFs在肝纖維化發(fā)生中的作用，并提出了需要進一步探索的領域。

對于門靜脈成纖維細胞的研究主要瓶頸在于缺乏可以分離或在體內(nèi)示蹤門靜脈成纖維細胞的表面標志物。Mourabi等[3- 4, 12]從大鼠肝臟膽道血管樹片段成功分離了門靜脈肌成纖維細胞，與肝干細胞不同，門靜脈間充質細胞可以產(chǎn)生高度增殖的、具有促血管生成特性的COL15A1+肌成纖維細胞。然而，在這些研究中門靜脈肌成纖維細胞的前體細胞尚未被真正確定。為此，Lei[11]從膽道血管樹分離并分選出門靜脈間充質細胞，使用生物信息學分析來進一步定義門靜脈間充質的細胞組成，確定了區(qū)分肌成纖維細胞亞群的標志物，并確定了PFs在小鼠和人類肝病病理中的作用。

為了確定門靜脈間充質細胞的組成，Lei等[13]從健康小鼠的膽管樹中分離出單細胞懸液，通過細胞分選富集了膽管細胞、內(nèi)皮細胞和造血細胞譜系標志陰性的細胞，再對這些富集之后的門靜脈間充質細胞進行單細胞RNA測序。無監(jiān)督聚類分析發(fā)現(xiàn)了16個細胞群，其中包括可能來自Glissonean 肝蒂的間皮細胞，以及四個在分選過程中被遺漏的內(nèi)皮細胞群。在間充質細胞成分中，他們確定了五個不同的成纖維細胞群和血管平滑肌細胞群，以及一個HSCs群。五個纖維細胞群均表達細胞外基質蛋白(包括幾種膠原蛋白)。然而，這些成纖維細胞群所展示出的獨特表達譜，暗示在纖維化形成過程中這些細胞具有不同的命運。例如，成纖維細胞群5與HSCs擁有共同的基因表達譜，表明該群可能是PFs和完全分化的HSCs之間的中間體。根據(jù)單細胞熵的測量，基于其信號混雜程度近似單細胞的分化潛能和可塑性，成纖維細胞群3和4被認為是潛在的前體細胞[14]。使用軌跡分析和GO分析對成纖維細胞、VSMC和HSC群以及干細胞標志物表達的分析，進一步支持成纖維細胞群3和4具有間充質干細胞多系分化的潛能和特征。這群細胞被稱為具有間充質干細胞特征(PMSCs)的PFs。這一研究揭示了門靜脈間充質復雜的細胞組成，并確定了可能是門靜脈肌成纖維前體細胞的細胞群。

細胞培養(yǎng)研究表明，PFs具有高度克隆性，表達間充質干細胞標志物，并能進行三系分化(間充質干細胞的一個特征)。與懸浮培養(yǎng)相比，在基質上平面培養(yǎng)時這些細胞會表現(xiàn)出門靜脈肌成纖維細胞的特征。因此，上述篩選策略和分離步驟確定了可能是門靜脈肌成纖維細胞前體細胞的PMSCs。隨后作者對靜止狀態(tài)的PMSCs和HSCs，以及兩者轉分化后形成的肌成纖維細胞進行群體 RNA測序，以尋找能夠劃分這兩種細胞群在靜止和肌成纖維狀態(tài)下的差異基因，從而用于肝臟纖維化組織分析。在向肌成纖維細胞分化的過程中，PMSCs在培養(yǎng)中是克隆性的，而HSCs則無分裂能力。轉錄組分析結果提示，Slit2是PMSC/PMSC-MF的特征基因，在PMSCs向肌成纖維細胞分化過程中始終穩(wěn)定表達，而在其他肝細胞類型，例如HSCs/HSC-MFs中幾乎沒有表達。體外研究發(fā)現(xiàn)，PMSC來源的Slit2可激活HSCs并促進內(nèi)皮細胞血管新生。熒光原位雜交分析表明，在小鼠肝病模型和人類肝硬化樣本中，SLIT2+PMSC來源的肌成纖維細胞在纖維化隔膜中沿著新生血管聚集，并被SLIT2-HSCs來源的肌成纖維細胞所包圍。因此Lei等認為，PMSCs的增殖可以促進血管新生和HSCs來源的肌成纖維細胞的累積。他們確定了PMSCs的標志物，明確了小鼠和人類肝臟樣本中門靜脈肌成纖維細胞的解剖分布和來源。PMSCs標志物可用于確定纖維化肝病中存在的肌成纖維細胞的類型，以及這些肌成纖維細胞如何在疾病不同階段對不同損傷做出反應，進而促進肝臟纖維化的形成。此外，這項發(fā)現(xiàn)還有助于研究不同纖維化細胞群與膽管細胞之間潛在的信號網(wǎng)絡。原發(fā)性硬化性膽管炎的組織學特點是管周和橋狀纖維化，這一病理過程可能同時或先后涉及PFs和HSCs[15]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性硬化性膽管炎中的膽管細胞對損傷的反應不一致。在受到損傷后，一些膽管細胞的細胞周期停滯(即衰老)，而其他膽管細胞發(fā)生導管反應并開始增殖[16]。這種對應激反應的差異及其與原發(fā)性硬化性膽管炎發(fā)病機制的關系仍不清楚。有數(shù)據(jù)表明，在疾病初始階段，活化的PFs是被招募到膽管周圍損傷部位的主要成纖維細胞類型，衰老膽管細胞相關的分泌表型可能在膽管周圍使PFs持續(xù)活化導致管周纖維化。當膽管反應的膽管細胞增殖超出原來的膽管結構時，HSCs的大量聚集可能導致疾病晚期實質橋接性纖維化。即衰老膽管細胞和PFs主要參與膽道周圍纖維化的發(fā)展和持續(xù)，而膽管反應性細胞和HSCs則參與實質纖維化的形成[17]。PMSCs的門靜脈定位使其成為膽汁纖維化的誘因，這可能涉及與其他細胞如膽管細胞、肝細胞、VSMCs及免疫細胞之間的細胞信號串擾。綜上，通過結合標準化的特征性標志物用于區(qū)分HSCs和PFs在不同病因下導致纖維化的差異，為進一步的研究奠定了基礎。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。