小鼠原代骨髓單核細胞分離與培養方法的改進

李香敏，王華，張春蕾，蒙軍平，張冰，張平

1.空軍軍醫大學第二附屬醫院腎臟內科，陜西 西安 710038；

2.空軍軍醫大學第一附屬醫院心血管外科，陜西 西安 710032

原代骨髓單核細胞(primary mouse bone marrow monocytes，pBMMC)的培養由于細胞離體時間短，生物學特性未發生很大變化，仍具有二倍體遺傳特性，最接近和反映體內生長特點，在藥物測試、細胞分化、轉化等研究領域應用廣泛。在細胞水平進行研究，最為關鍵的是細胞狀態穩定，后期的實驗結果才能夠更加穩定、可信[1]。由于pBMMC提取步驟復雜，各實驗室方法不盡相同，培養所得的原代細胞質量不穩定。目前常用的提取方法未注意到熱缺血對細胞的影響，未進行預冷處理[2-4]。因此，為探索更好的原代小鼠骨髓單核細胞的分離與培養方法，本研究引入“熱缺血”這一概念，進而探討熱缺血損傷對原代骨髓單核細胞分離提取的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物選取SPF級C57BL/6小鼠，雄性，6~8周齡，購自空軍軍醫大學實驗動物中心。實驗過程中對動物的處置符合國家科技委員會頒布的《實驗動物管理條例》相關動物倫理學標準的條例。

1.1.2 實驗試劑紅細胞裂解液(康為公司)，DMEM、胎牛血清(GIBCO公司)，巨噬細胞集落刺激因 子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)(Peprotech公司)，PE anti-mouse F4/80(e Bioscience公司)，APC anti-mouse CD11b(Biolegend公司)，7AAD抗體(BD公司)，轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)β1和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)購自abcam公司。

1.1.3 實驗儀器Thermo Forma 3111 CO2培養箱(Thermo Scientific)、超凈工作臺(美國，Thermo Scientific)、FACScalibur流式細胞儀(BD Immunocytometry Systems)。

1.2 方法

1.2.1 實驗物品準備眼科剪、眼科彎鑷、2 mL注射器、1×磷酸鹽緩沖液(PBS)、10 cm培養皿、400目尼龍篩、吸管、酒精燈；紅細胞裂解液等。

1.2.2 骨髓組織取材(1)預冷組(pre-cooling group，Pre-cool)：將6~8周齡的小鼠脫臼處死，置于75%酒精中浸泡2 min消毒；在無菌超凈臺中，完整取出雙側股骨，置于預冷的PBS緩沖液中，剔除殘留肌肉組織；將股骨移至另一平皿中，剪去股骨頭，暴露骨髓腔，用2 mL無菌注射器吸取PBS自遠端刺入并沖洗骨髓腔3次，吹打混勻骨髓組織，制成單細胞懸液；用無菌400目尼龍篩過濾至15 mL離心管中，1 200 r/min離心4 min(4℃)；棄上清，加入紅細胞裂解液3~5 mL(10倍體積)重懸，冰上靜置5 min，加入等體積PBS終止裂紅，同上離心；棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養液3 mL重懸，接種于10 cm平皿中，搖動混勻，放入37℃培養箱(5%CO2)。(2)對照組(control)：操作步驟如上述，所有操作均在室溫進行。

1.2.3 向單核巨噬細胞誘導分化將提取的骨髓單核細胞培養6~8 h后，吸取培養皿中上層懸液即未貼壁的細胞懸液至15 mL離心管中，同上離心；棄上清，用10%FBS的DMEM培養液3 mL重懸，接種至6孔板培養皿中，加入M-CSF 25 ng/mL，放入37℃培養箱；3 d后進行細胞換液，并加入同濃度M-CSF，7 d后即可得到高純度的單核巨噬細胞。

1.2.4 細胞純度鑒定用胰蛋白酶消化單核巨噬細胞，待細胞呈圓形后，終止消化，輕輕吹打至細胞完全脫落，移入15 mL離心管，同上離心；棄上清，加入大鼠血清10μL封閉，冰上10 min后，加入40μL流式細胞液震蕩重懸；加入熒光標記的流式細胞抗體進行染色：PE anti-mouse F4/80、APC anti-mouse CD11b，4℃避光，30 min；加入流式細胞液3 mL，同上離心洗去多余抗體；棄上清，加入500μL含7AAD抗體的流式細胞液，進行流式細胞學檢測。

1.2.5 單核巨噬細胞功能驗證在骨髓單核巨噬細胞培養第5天時進行細胞換液，同時加入TGF-β1(10 ng/mL)M-CSF(25 ng/mL)，培養3 d，即可觀察到細胞形態學發生變化。通過Western Blotting檢測肌成纖維細胞標志物α-SMA的表達水平。

1.3 統計學方法采用Prism 9.2統計軟件進行數據統計分析。文中所有數值均以n個獨立實驗的平均值±標準誤(standard error of mean，SEM，±s)表示。兩組間數據比較采用配對t檢驗。P≤0.05(雙側)為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠原代骨髓單核巨噬細胞的形態在小鼠骨髓單核細胞培養液中加入M-CSF 25 ng/mL，光鏡下觀察細胞大小、形態變化及細胞增殖情況。1 d后可見細胞已貼壁，呈圓形，體積較小，散在分布。培養3 d后進行換液，同時補加同濃度M-CSF繼續誘導，光鏡下可見細胞增生，部分伸出偽足(圖1)。

圖1 培養3 d時光鏡下小鼠骨髓單核巨噬細胞圖片(20×；bar：50μm)Figure 1 Bone marrow mononuclear macrophage of mice cultured for 3 days(20×;bar:50μm)

2.2 小鼠原代骨髓單核巨噬細胞純度鑒定收集培養7 d的骨髓單核巨噬細胞，通過流式細胞儀檢測骨髓單核巨噬細胞表面抗原，結果顯示對照組CD11b+F4/80+的細胞比例占94.8%，預冷組為96.3%，較對照組細胞純度有所升高，采用配對t檢驗進行統計分析，差異無統計學意義，P＞0.05(圖2)。

圖2 骨髓單核巨噬細胞流式細胞儀純度鑒定Figure2 Purity identification of bonemarrow mononuclear macrophagesby flow cytometry

2.3 小鼠原代骨髓單核巨噬細胞功能驗證在加入TGF-β1共培養后可見部分細胞死亡，部分細胞形態發生改變，呈細長紡錘形，如圖3所示。通過Western Blotting進一步驗證，結果顯示經TGF-β1誘導后肌成纖維細胞標志物α-SMA的表達較對照組升高，差異有統計學意義，P＜0.05(圖4)。

圖3 培養7 d后BMDM的細胞形態及加入TGF-β1誘導后細胞形態變化Figure 3 Cell morphology of BMDM after 7 days of culture and morphological changesof cells after TGF-β1 induction

圖4 小鼠骨髓單核巨噬細胞功能驗證Figure 4 Functional verification of bone marrow mononuclear macrophages of mouse

3 討論

原代骨髓單核細胞培養由于細胞離體時間短，生物學特性未發生很大變化，仍具有二倍體遺傳特性，最接近和反映體內生長特點，在藥物測試、細胞分化、轉化等研究領域應用廣泛。在細胞水平進行研究，最為關鍵的是細胞狀態穩定，后期的實驗結果才能夠更加穩定、可信[1]。因此，在分離提取細胞的過程中，盡可能地消除一些可控因素，減少對細胞可能產生的損傷。但由于pBMMC提取步驟復雜，各實驗室操作方法不盡相同。目前，pBMMC的提取方法主要有三種：(1)密度梯度離心法：該方法的原理是根據不同細胞間密度的差別進行細胞分離，分離效果好，但操作嚴格，不易掌握。(2)免疫磁珠分離法：該法是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合的原理，分為正選法和負選法。在正選法中，磁珠結合的細胞就是所要分離獲得的細胞；而在負選法中，磁珠結合不需要的細胞，游離于上清液中的細胞為目的細胞。這是一種簡單高效的分離方法，僅需磁性分離器，不需要專業設備輔助；但需要將提取的細胞標記抗體并進行磁珠分選，耗時長，且容易污染。(3)差速貼壁法：是利用成纖維細胞、星形膠質細胞和成鞘細胞貼壁時間的不同而將它們分離的方法。本研究在原有差速貼壁法的基礎上，引入“熱缺血”這一概念，縮短細胞離體后的熱缺血時間，減輕細胞熱缺血損傷，維持細胞處于良好的狀態，提高細胞質量，以保障后續實驗結果的穩定性。本實驗室采用第三種方法提取pBMMC，該方法的優勢在于操作相對簡單，初學者容易掌握；且提取過程相對較快，從細胞離體到放入培養箱的時間較短，不易污染。目前常用的分離提取方法未注意到熱缺血對細胞的影響，未進行預冷處理[2-4]，培養所得的原代細胞的熱缺血損傷較重。因此，探索熱缺血在原代骨髓單核細胞的分離提取中的影響具有重要的意義。

器官從供體供血停止到冷灌注(冷保存)開始的這段時間血流中斷，但是器官組織仍繼續進行代謝，因氧和各種代謝底物供應缺乏而器官仍處于較高的代謝水平，所以器官缺血損害出現較快、程度較重，對器官的損害最為嚴重[5-7]。因此，縮短熱缺血時間在原代細胞分離培養中具有重要意義。本研究中引入“熱缺血”這一概念，細胞自離體到放入培養箱這一段時間內，盡可能在冰上操作，保持細胞在0℃~4℃，縮短熱缺血時間，盡量減少對細胞帶來的損傷。本實驗中將小鼠脫臼處死后在75%的酒精中浸泡消毒時間有5 min縮短為2 min，在取出股骨的后續操作均在冰上進行，包括殘留肌肉組織的剔除、骨髓腔的沖洗、尼龍篩過濾及紅細胞裂解這些步驟，有效縮短了細胞的熱缺血時間。在放入培養箱6~8 h后，留取培養皿中上層懸液，棄去已貼壁的成纖維細胞等，培養液中同時加入定向誘導因子M-CSF，促進單核細胞向單核巨噬細胞定向誘導分化。3 d后進行細胞換液，去除凋亡細胞及細胞有害產物，7 d后即可獲得生物學特性保持良好的原代小鼠骨髓單核巨噬細胞。CD11b是單核細胞的表面標志性抗原，F4/80是巨噬細胞的表面標志性抗原，流式細胞學檢測結果顯示單核細胞的純度為96.3%。在第5天時加入TGF-β1共培養3 d后細胞轉分化為成纖維細胞，α-SMA的表達升高，證明所提取的原代小鼠骨髓單核細胞狀態良好、功能穩定，可用于后續的實驗研究。

總之，減少消毒時間，加快小鼠股骨的剝離，后續在冰上進行操作，縮短細胞熱缺血時間，能夠有效地減低骨髓細胞損傷，可獲得狀態良好純度高的小鼠骨髓單核巨噬細胞。