腫瘤教化血小板轉錄組中miRNA區(qū)分肺結節(jié)良、惡性的可行性研究進展

呂堯蘭 綜述 金健 審校

1.遵義醫(yī)科大學，貴州 遵義 653000；

2.成都大學附屬醫(yī)院胸心外科，四川 成都 610036

肺癌是全世界范圍內發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，也是我國近30年來發(fā)生率增長最快的惡性腫瘤。2020年全世界肺癌發(fā)病率和死亡率均居前位，新發(fā)病例約220萬，死亡約180萬[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性，多年來國內外一直致力于通過篩查來實現(xiàn)NSCLC的的早診早治，以期降低NSCLC的相關死亡率，但效果欠佳，即使是接受了根治性手術的NSCLC患者，也有45%在8~18個月內出現(xiàn)復發(fā)或轉移[2]。盡管在診斷和新型靶向藥物方面取得了新進展，NSCLC的預后仍然很差，因為生存時間與NSCLC的臨床分期直接相關，不同的臨床分期的預后有著顯著差異，所以NSCLC的早期診斷和有效的治療是延長生存時間的有效方法，能使患者有更好的轉歸。

目前臨床上常用的NSCLC診斷技術有：影像學、實驗室(病理)、內窺鏡以及近年興起的液體活檢等方法。其中液體活檢是一種分析血液等非實質性生物組織來診斷或檢測腫瘤的方法[3]，具有低創(chuàng)傷、標本易獲取、可以反映腫瘤的整體狀態(tài)、實現(xiàn)實時檢測等優(yōu)點。其中腫瘤教化血小板(tumor-educated platelets，TEPs)作為新型液體活檢標志物來源，其轉錄組中MicroRNA(miRNA)是目前用于檢測早期NSCLC的熱門生物標志物。本文就TEPs轉錄組中miRNA區(qū)分肺結節(jié)良、惡性的可行性進行綜述。

1 TEPs概述

TEPs是指惡性腫瘤患者中的癌細胞與血小板相互作用時，通過多種方式影響血小板RNA表達譜的血小板[4-5]，被認為由癌癥存在時的局部和系統(tǒng)性應答轉化而來[6]。TEPs是含有腫瘤RNA的血小板，是腫瘤源性RNA的重要來源[4]。血小板不僅可以根據(jù)腫瘤釋放的信號進行剪接，血小板與腫瘤釋放的某些生長因子的相互作用也會改變血小板中存在的mRNA的表達。這種由于血小板與腫瘤相互作用而導致的血小板內mRNA的差異表達可被用作早期癌癥檢測或癌癥轉移的生物標記物[7]。

1.1 血小板生理血小板來源于骨髓巨核細胞的無核循環(huán)細胞片段，具有動態(tài)的生物學功能，包括止血、動脈血栓形成、免疫、炎癥、血管重塑和血管生成[7]。血小板大量存在于血液中，是外周血中第二豐富的細胞類型[8]。研究表明肺對血小板生成的貢獻很大，約占血小板總產量的50%，并通過實驗證明肺是終末血小板生成的主要場所，也是具有相當造血潛能的器官[9]。也就是說，當肺部存在結節(jié)時，血小板可能會從結節(jié)組織中穿過，受到結節(jié)的影響從而改變自身的RNA，為研究提供了理論依據(jù)。而通過RNA結合噻唑橙染色測定，年輕的網狀血小板的總RNA濃度增加了20~40倍[10]，這表明年輕的血小板含有更多的(未切割的)RNA，這些RNA可能在血小板循環(huán)或激活時衰變或釋放，在血小板激活之前提取RNA，可以獲得大量RNA。目前發(fā)現(xiàn)的血小板含有豐富的RNA種類，包括mRNA(前RNA和mRNA)、核糖體RNA(r-RNA)、microRNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、反義RNA(as-RNA)和轉移RNA(t-RNA)[11]。其中，MicroRNAs(miRNA)是一個小的非編碼RNA家族(21-25個核苷酸)，可以通過堿基配對到靶信使RNA(mRNA)的互補位點來抑制mRNA的翻譯和促進mRNA的降解[12]。通過這種機制，miRNA在轉錄后改變了基因表達，而這種改變能夠被發(fā)現(xiàn)，借以觀察肺良、惡性結節(jié)之間的差異性。

1.2 血小板與腫瘤細胞血小板與腫瘤細胞之間存在相互作用。一方面，腫瘤細胞可以“教育”血小板，影響循環(huán)血小板的數(shù)量和激活狀態(tài)，并使其轉錄組發(fā)生剪接或拼接，導致功能發(fā)生改變；另一方面，腫瘤教化的血小板含有過多的活性生物分子，包括血小板特異性和循環(huán)攝取的生物分子，這些生物分子在血小板活化后釋放并參與惡性腫瘤的進展。NSCLC患者外周血中TEPs可能處于“半激活”狀，這就使得血小板容易被腫瘤細胞激活或者聚集[13-14]，激活后的血小板可能改變了原有的miRNA序列，使其與健康人、良性結節(jié)之間的miRNA存在表達差異，應用二代測序技術檢測并分析miRNA表達差異序列，就有可能區(qū)分早期NSCLC與健康人、良性結節(jié)。

2 TEPs應用

血液的液體活檢是目前腫瘤研究的熱點，已有部分應用于臨床，具有以下優(yōu)勢：(1)早期發(fā)現(xiàn)癌癥(篩查)；(2)確定個性化治療的新靶點；(3)預處理治療反應；(4)早期治療反應監(jiān)測和“實時”評估治療效果；(5)早期發(fā)現(xiàn)疾病復發(fā)[10,15]。其中TEPs具有數(shù)量大、易提取、擁有大量RNA等特點，在NSCLC的早期診斷領域具有深入研究價值。

2.1 TEPs RNA與NSCLC目前臨床上肺部常用的早篩方法存在較多局限，而基于血液的TEPs具有微創(chuàng)性、重復取樣可能性、較低成本等優(yōu)點[16]，且大量研究提出TEPs檢測早期NSCLC有較高的檢出率。2015年Best等[17]首次使用Thrombo-Seq技術評估腫瘤患者與健康人的TEPs mRNA表達譜，以96%的準確率區(qū)分癌癥患者和健康人。在6種腫瘤類型(NSCLC、膠質母細胞瘤、結直腸癌、乳腺癌、肝膽癌和胰腺癌)中正確地確定了腫瘤的位置，準確率為71%。之后，該團隊證明了粒子群優(yōu)化算法(PSO)能使早期和晚期NSCLC的TEP檢測準確率提高至81%、88%，并獨立于個體年齡、吸煙習慣、全血儲存時間，PSO算法對NSCLC診斷的準確性隨著樣本的增加而提高，與年齡、吸煙狀況、血液儲存以及各種炎癥狀態(tài)無關[18]。在此團隊之后，其他團隊也證實了檢測TEPs的RNA序列在NSCLC早期篩查中的應用。Sheng等[19]通過分析NSCLC患者和健康對照組TEP-RNA的測序數(shù)據(jù)，鑒定了48個TEP生物標志物，這些生物標志物可以準確篩查出NSCLC患者；Zhang等[20]應用RNA-seq檢測健康人和NSCLC患者的血小板，結果顯示血小板RNA-Seq在區(qū)分腫瘤組織學類型方面具有診斷潛力。由此可見，TEP-RNAs可作為腫瘤的生物標志物，且在NSCLC的早期診斷中的地位越來越重要，是個體化治療的基礎之一。

盡管上訴研究已經闡明了TEPs轉錄組在NSCLC中的應用——通過分析TEPs mRNA表達譜，以較高的準確率區(qū)分癌癥患者和健康人，但大多數(shù)研究包含過多晚期病人，且對照組只選擇健康人，或無良性對照組，重點在于區(qū)分健康人和NSCLC患者，對于結節(jié)的良惡性并沒有給出明確依據(jù)。而隨著科技進步，人們健康意識的提高，越來越多的人通過體檢發(fā)現(xiàn)肺部存在結節(jié)，其中有大部分結節(jié)，臨床上也無法準確判斷其良、惡性。據(jù)報道肺結節(jié)診斷或治療學手術中有30%~50%的術后病理診斷為良性[21-22]，從而導致不必要的手術，造成醫(yī)療資源浪費，家庭社會負擔加重。因此，篩查出肺部結節(jié)的良、惡性才是目前研究的重點難點。

2.2 miRNA與NSCLCmiRNA是一類內源性的、單鏈的、小的非編碼RNA分子(21~25個核苷酸)，對基因表達的轉錄后調節(jié)至關重要[23-25]，相對穩(wěn)定、體積小、基因表達調控顯著是miRNA區(qū)別于mRNA的獨特特征，是一種新的生物標志物和潛在的治療靶點[26]，miRNA被發(fā)現(xiàn)在NSCLC中經常失調，并且與NSCLC的生長、復發(fā)和轉移有關[27-28]。因此，miRNA被認為是診斷NSCLC的有價值的生物標志物。

近年來對miRNA的研究如雨后春筍般快速進步，越來越多證據(jù)證明miRNA是診斷癌癥的重要標志物來源。其中Chen等[29]在400例NSCLC患者和220例對照組中，從全基因組血清miRNA表達譜中鑒定10種血清miRNA作為非小細胞NSCLC診斷新的無創(chuàng)生物標志物；此外，Akanksha Khandelwal等[30]通過實時定量PCR檢測NSCLC患者血漿樣本中的miRNA，結果表明miR-590-5p通過調節(jié)STAT3通路在NSCLC中發(fā)揮抑癌作用，可能作為NSCLC診斷的有用生物標志物，并作為NSCLC治療的潛在靶點；Zhang等[31]通過qRT-PCR分析了81例NSCLC患者肺腫瘤組織及其配對的非腫瘤組織標本進行miRNA和mRNA芯片分析，結果提示miRNA可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，可能是NSCLC的有效診斷標志物。上述研究提供了可靠的證據(jù)，證明miRNA譜的改變可能使miRNA成為腫瘤早期診斷可靠生物標志物。而有部分研究表示miRNA已被證明是NSCLC早期檢測的可靠生物標志物[32-33]。盡管研究中的miRNAs來源各不相同，但均需提取出穩(wěn)定的RNA，不可否認的是，在外周血中也可檢測到穩(wěn)定形式的腫瘤相關miRNA，且TEPs中的miRNA更穩(wěn)定、含量高、且不易受到酶的影響。因此,TEPs轉錄組miRNA有望成為NSCLC高危人群早期篩查的重要生物標志物。

此外，Xing等[34]證實血小板RNA測序可以識別用于NSCLC檢測的TEP生物標志物，用定量實時聚合酶鏈反應(q-PCR)對NSCLC患者、良性肺結節(jié)和健康對照者進行檢測，提取和檢測血小板轉錄組不僅可以區(qū)分癌癥患者和健康人，而且還可以進一步區(qū)分鱗癌和腺癌、區(qū)分癌癥和良性結節(jié)。而Florczuk等[35]從循環(huán)外顯體分離的miRNAs作為區(qū)分肺腺癌和肉芽腫的標志物更是為miRNA區(qū)分肺結節(jié)的良、惡性提供可靠依據(jù)。相較于外顯體，血小板在提取技術上較完善、提取方法也較為簡單，且擁有大量RNA，有研究表明含有大量的動態(tài)mRNA的血小板可應用于腫瘤的診斷[36-37]。因此，基于血小板轉錄組檢測的液體活檢具有數(shù)量大、易提取等特點，在腫瘤的診斷領域具有深入研究價值。

3 展望

肺癌是目前世界上死亡率較高的惡性腫瘤，我國第三次死因回顧調查顯示肺癌居于癌癥死亡原因首位，在高危人群中開展肺癌篩查有益于發(fā)現(xiàn)早期肺癌，提高NSCLC的生存率。歐洲肺癌篩查試驗最新研究顯示，通過低劑量螺旋CT(LDCT)篩查，男性NSCLC死亡率降低24%，女性NSCLC死亡率降低33%[38]，總的來說，LDCT篩查顯著提高了Ⅰ期NSCLC的檢出率，降低了NSCLC死亡率。臨床上常用的生物標志物在晚期診斷中比早期更準確，而IA期NSCLC患者5年生存率約為80%，Ⅲ期NSCLC患者5年生存率僅為20%左右，因此，在發(fā)現(xiàn)肺部結節(jié)之后，能否通過非手術方法有效的發(fā)現(xiàn)其良、惡性，是亟待解決的問題。

近5年，關于各類腫瘤液體活檢的研究顯著增加，液體活檢檢測的主要成分包括循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、細胞外囊泡(EVs)、循環(huán)腫瘤細胞(CTC)，以及TEPs等，但研究表明在高度侵襲性的NSCLC患者血液中CTC和ct-DNA含量非常低，特別是在早期NSCLC患者的血液中含量更低。而基于外泌體診斷NSCLC的研究也是如火如荼，已取得一定成績，但提取方法過于復雜，臨床推廣性較差。TEPs作為新型液體活檢來源，相對于其他液體活檢來源來說，具有豐度高、易分離、易儲存、易檢測等優(yōu)勢，且其中的RNA受到血小板的保護，比較穩(wěn)定，不易受內源性RNA酶的影響[39]，因此TEPs轉錄組中miRNA在肺結節(jié)的性質診斷方面有著巨大的潛力。在前期工作中，研究團隊收集了部分NSCLC以及肺良性結節(jié)、正常健康人血小板，并提取總RNA檢測miRNA譜，發(fā)現(xiàn)肺腺癌與肺良性結節(jié)在部分區(qū)域表達有著顯著差異[40]，從而說明血小板轉錄組分子標準物具有進一步研究價值。

TEPs為區(qū)分癌組織和非癌組織的潛在生物標志物提供了一個有前途的新來源，這也是未來基于血液的生物標志物研究中能夠進一步擴展的。隨著人們健康意識不斷提高，肺部結節(jié)也不斷被發(fā)現(xiàn)，為了減少社會及家庭負擔，避免醫(yī)療資源浪費，明確肺部結節(jié)的性質是目前亟待解決的問題。目前許多關于miRNA的研究依然不少，然而，miRNA在臨床上進行診斷的應用卻不容樂觀，主要原因是不同研究之間缺乏可重復性，而這種不一致的原因可能是血小板miRNAs水平的個體間變異；另外，由于病例數(shù)量有限，現(xiàn)仍缺少大規(guī)模研究。為使miRNA能更廣泛應用于臨床，需要提升檢測技術的靈敏度和特異性、擴大臨床試驗規(guī)模。