PD-L1表達、CD8+TIL密度與食管鱗癌臨床病理特征及預后的關系

陳輔葉，劉永紅，董國娟，麥麥提江·莫明，阿力木尼亞孜·亞森，伍健

1.莎車縣人民醫院病理科，新疆 莎車 844700；

2.莎車縣人民醫院省部共建中亞高發病成因與防治國家重點實驗室，新疆 莎車844700；

3.浦東新區浦南醫院病理科，上海 200125

食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)為食管癌最常見的病理類型，約占食管癌的95%。ESCC預后較差，五年生存率低于10%，嚴重威脅人民群眾的身體健康。新疆是ESCC的高發地區，其中以哈薩克族人群發病率最高，可能和當地人飲食習慣和環境因素有關[1]。新疆常住漢族人群ESCC的發病率為13/10萬，而哈薩克族發病率可達到155.9/10萬，是漢族人群的10余倍[2]。新疆莎車縣是維吾爾族人口最多的地區，ESCC是當地的常見病和高發病。

腫瘤的免疫微環境在腫瘤發病機制中的作用越來越受到人們的重視。程序性死亡-配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)信號通路的激活可以產生強大的免疫逃逸作用，其已成為免疫治療新的熱點。然而，對于惡性腫瘤組織中PD-L1表達的臨床預測也有一些自相矛盾的研究結果[3-4]。CD4+或CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltration lymphocytes，TIL)代表了宿主對惡性腫瘤的免疫能力，對于評估機體抗腫瘤的免疫能力有重要意義[5]。本研究采用免疫組化方法對ESCC腫瘤細胞PD-L1表達和CD8+TIL密度進行檢測，分析它們與臨床病理特征或患者總體生存時間(overall survival，OS)間的相關性，以期探討PD-L1表達和CD8+TIL密度在ESCC預后和腫瘤免疫治療中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集新疆莎車縣人民醫院病理科2016年6月至2021年6月ESCC標本167例(活檢標本110例及根治標本57例)進行回顧性研究。其中男性116例，女性51例；平均年齡(64.99±9.09)歲；發生在食道上段31例、中段48例和下段88例。57例ESCC根治標本中，腫瘤平均(4.89±1.84)cm，其中Ⅰ~Ⅱ期38例，Ⅲ~Ⅳ19例。入組病例臨床病理資料均完整，病理切片均經過兩名高年資病理醫師獨立復片，有診斷分歧的切片經第三名病理醫師閱片后協商決定。所有患者術前均未實施放化療等其他方案治療，其中142例患者(110例活檢標本和32例手術根治標本)有隨訪資料。本研究經新疆莎車縣人民醫院倫理委員會批準后實施。

1.2 方法

1.2.1 設計與制備組織芯片組織芯片由蘇州百道醫療公司制備并提供技術支持。選取符合入選標準的食管癌根治標本的蠟塊，采用雙盲法由病理醫師對石蠟標本中有代表性的部位進行標記。設計為10個組織陣列，用直徑1.5 mm的細針打孔，將供體蠟塊中標記好的組織芯取出后整齊排列到受體蠟塊上，制成組織芯片蠟塊。

1.2.2 免疫組化將符合入選標準的ESCC活檢組織蠟塊及根治標本組織芯片進行4μm厚切片后行HE及免疫組織化學染色。切片經脫蠟、水化、抗原修復后，滴加一抗PDL-1(美國，Abcam公司，兔抗人，貨號：ab228415)和CD8(蘇州百道，兔抗人，貨號：PA577)，37℃水浴箱孵育2 h后加二抗，DAB顯色，蘇木精對比染色，常規脫水，透明和封片。

1.2.3 免疫組化評分免疫組化評分參照Sinicrope等采用半定量評分法進行，采用雙盲法對每張切片在高倍鏡(×400)下計數10個視野[6]。PD-L1的評分方法如下：染色強度分別計0~3分(無表達為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分)乘以陽性細胞所占百分比評分(＜1%為0分，1%~5%為1分，6%~25%為2分，25%~50%為3分，＞50%為4分)。總分0~1分為PD-L1低表達組；總分2~12分為高PD-L1表達組。CD8+TIL的密度判斷方法如下：40倍鏡下計數10個熱點區域CD8+細胞總數，陽性細胞總數除以300后得到評分，當CD8+細胞＜100個時，評分為0；細胞＞1 200個時，為5分。總分0~2分為CD8+TIL低密度組；總分3~5分為CD8+TIL高密度組。

1.3 統計學方法應用SPSS20.0統計學軟件對數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示；采用χ2檢驗分析PD-L1表達、CD8+TIL密度和臨床病理特征的關系；Kaplan-Meier單因素法分析PD-L1表達、CD8+TIL密度與OS的關系，并繪制生存曲線圖；單因素和多因素COX比例風險模型回歸分析風險因子和OS的關系；Kaplan-Meier單因素法分析不同PD-L1表達/CD8+TIL密度亞組與OS的關系。均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤細胞PD-L1和TIL CD8免疫表達PD-L1表達主要定位在腫瘤細胞膜和細胞漿，見圖1。

圖1 免疫組化標記PD-L1和CD8Figure1 Immunohistochemical markersof PD-L1 and CD8

2.2 PD-L1表達、CD8+TIL密度與臨床病理特征的關系χ2檢驗分析發現，PD-L1表達在不同腫瘤浸潤深度組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，腫瘤細胞浸潤至食道被膜時，PD-L1的表達較高。CD8+TIL密度在是否有淋巴結轉移組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，CD8+TIL低密度組易發生淋巴結轉移。同時，χ2分析顯示PD-L1表達在不同CD8+TIL密度組間比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，PD-L1高表達組CD8+TIL密度較高，見表1。

表1 PD-L1表達、CD8+TIL密度和臨床病理特征的關系[例(%)]Table1 Relationship between PD-L1 expression,CD8+TIL density and clinicopathological features[n(%)]

2.3 PD-L1表達、CD8+TIL密度與生存的關系Kaplan Meier單因素生存分析結果顯示，PD-L1低表達組或CD8+TIL高密度組預后較好，組間比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 食道癌患者Kaplan-Meier生存曲線Figure2 Kaplan-Meier survival curveof esophageal cancer patients

2.4 單因素和多因素COX回歸分析生存相關危險因素單因素COX回歸分析結果顯示，性別、PD-L1表達和CD8+TIL密度與預后相關(P＜0.05)，女性、低PD-L1表達或高CD8+TIL密度的患者預后較好。多因素COX回歸分析結果顯示PD-L1表達和CD8+TIL密度是預測ESCC預后的有效指標(P＜0.05)，見表2。

表2 單因素和多因素COX生存預后回歸分析Table2 Univariateand multivariate COX regression analysisof survival prognostic factors

2.5 PD-L1表達和CD8+TIL密度亞組與生存的相關性Kaplan-Meier單因素法分析不同PD-L1表達和CD8+TIL密度亞組與生存的關系結果顯示，低PD-L1表達/高CD8+TIL密度亞組預后最好，高PD-L1表達/低CD8+TIL密度亞組預后最差，各亞組間比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 食道癌PD-L1表達、CD8+TIL密度不同亞組生存曲線Figure 3 Survival curves of esophageal cancer patients with different PD-L1 expression and CD8+TIL density

3 討論

中國是ESCC的高發國家，男，女發病比例約為2∶1。新疆ESCC高發可能與炎癥、創傷、遺傳以及生活習慣等因素有關，但具體機制不詳。大部分ESCC患者為中晚期，5年生存率不足20%。隨著新輔助化療，微創手術和精準放療等治療手段的進步，5年生存率提升到30%左右；ESCC仍是威脅人民健康的常見惡性腫瘤。目前，基于過繼細胞療法、抗體和疫苗的免疫治療，通過防止免疫逃逸和改變免疫反應，為多種惡性腫瘤的治療帶來新的希望[7]。

PD-L1是分子量為40 kDa的跨膜蛋白配體，與PD-1受體結合后，傳遞抑制信號，阻止T細胞活化和增殖，誘導T細胞凋亡[8]。PD-L1和鱗狀細胞癌關系密切。口咽、上頜竇、舌和宮頸等部位的鱗狀細胞癌PD-L1表達增高，并與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關[9-10]。預后相關的研究也表明，PD-L1表達與皮膚和喉部鱗狀細胞癌患者預后相關，陽性表達者預后較差[11-12]。在ESCC的研究表明，PD-L1在腫瘤組織中表達增高，表達強弱和腫瘤浸潤深度、pTNM分期及預后有關[13-15]。我們在新疆維吾爾族ESCC患者中的研究表明：PD-L1表達僅和腫瘤浸潤深度有關，和性別、年齡、發生部位、分化程度、TNM分期和有無淋巴結轉移無關，PD-L1表達較低的患者預后相對較好。

腫瘤周圍炎細胞如M1巨噬細胞、樹突細胞、CD4+Th1細胞和CD8+NK細胞對腫瘤生長具有抑制作用。TIL能釋放大量的細胞毒性細胞因子，抑制和殺死腫瘤細胞，誘導腫瘤細胞凋亡，減少淋巴結和遠處轉移。我們的研究表明，CD8+TIL密度和ESCC淋巴結轉移和預后有關系，CD8+TIL高密度患者的預后較好。三陰性乳腺癌的研究表明，PD-L1表達和患者預后無關，但TIL具有預后價值，且和腫瘤PD-L1表達有相關[16]。這些研究均表明TIL可能在患者腫瘤免疫和預后方面發揮重要的作用。

研究顯示TIL的存在與黑色素瘤患者局部腫瘤PD-L1表達密切相關[17]。研究也表明PD-L1表達和CD3+或CD8+TIL密度之間存在關聯；PD-L1表達高，則TIL密度也增高[4，18]。這些研究結果和我們的研究結果一致。我們的研究證實，腫瘤細胞PD-L1表達在不同CD8+TIL密度組間差異有統計學意義，PD-L1表達高則CD8+TIL密度高，兩者之間存在一定的關系。有研究認為TIL釋放炎性細胞因子，尤其是干擾素-γ，會誘導腫瘤組織PD-L1表達上調，作為一種適應性免疫抵抗機制，抑制局部效應T細胞的功能以抵抗自身免疫攻擊[8]。

根據TIL和PD-L1表達的存在或不存在，可以分為四種不同類型的腫瘤微環境[19]。對膽囊癌進行類似的免疫分型后，發現CD8+TIL高密度/PD-L1低表達亞型具有較好的預后[20]。一項非小細胞肺癌的研究表明，高PD-L1表達/高CD8+密度亞組的患者預后最好，且PD-L1表達和患者生存無關[21]。在對乳腺癌不同亞型的預后進行分析后發現，高TIL密度/PD-LI高表達的病例免疫活性更高[22]。因此，腫瘤免疫在不同腫瘤發病機制中所起的作用有所不同。我們的研究表明，高TIL密度/低PD-L1表達亞組的預后較好，低TIL密度/高低PD-L1表達亞組的預后較差。目前，基于TIL密度和PD-L1表達的ESCC免疫分型的研究未見文獻報道，在這一方面展開進一步的研究具有積極意義。

由于ESCC的放化療效果不佳，ESCC的免疫治療被寄予厚望。腫瘤組織PD-L1高表達是對腫瘤-宿主關系的一種適應性機制，免疫檢查點治療對這類腫瘤患者可能有效，并改善病程[17]。對新輔助化療和手術切除腫塊的晚期ESCC或賁門癌患者給予PD-1抑制劑納武單抗處理后，OS明顯改善，中位無病生存期由安慰劑組的11個月提高到22.4個月[7,23]。抗PD-1抗體帕博利珠單抗在晚期轉移性ESCC治療的臨床試驗中也取得了不錯的療效[24]。

惡性腫瘤組織中TIL的存在提示患者預后較好，也能提高一些常規療法和免疫治療的療效[25]。一般認為，TIL高密度/PD-L1高表達亞組的免疫治療效果最好，TIL低密度/PD-L1低表達亞組的免疫治療效果最差。免疫治療已成為腫瘤的主要治療方式之一。然而，目前大多數癌癥患者沒有從免疫治療中獲益的原因是腫瘤血管的異常，其促進了免疫逃逸[26]。因此，聯合使用抗血管生成藥物和免疫檢查點抑制劑，可以改善腫瘤微環境，潛在改善某些預后較差ESCC亞組患者的預后。

綜上所述，PD-L1表達和CD8+TIL密度可以作為判斷ESCC患者預后的有效標志物，聯合使用抗血管生成藥物和免疫檢查點抑制劑，可能為某些免疫治療預后較差的亞組提供新的手段。