miR-532-3p、MAPK在非小細(xì)胞肺癌患者靶向治療耐藥中的表達(dá)及其相關(guān)性分析

馬彥娥，符號(hào)，郝光軍，李婷

榆林市第一醫(yī)院腫瘤診療中心，陜西 榆林 719000

肺癌患病人數(shù)多，以非小細(xì)胞肺癌為主，約占所有新發(fā)癌癥的13%。多數(shù)患者在首次診斷時(shí)，常因病情嚴(yán)重(中晚期)而失去外科手術(shù)的最佳機(jī)會(huì)，其5年生存率低[1]。目前，抗腫瘤藥物治療是延長(zhǎng)中晚期患者生命的主要方法。靶向治療是在細(xì)胞分子水平上，針對(duì)已經(jīng)明確的致癌位點(diǎn)的治療方式。在非小細(xì)胞肺癌中，表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是常見(jiàn)的驅(qū)動(dòng)基因，其突變率高達(dá)60%[2]。臨床常使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs)對(duì)此類患者進(jìn)行靶向治療，而獲得性耐藥是影響療效的關(guān)鍵因素，因此，探討與EGFR-TKIs耐藥相關(guān)的輔助指標(biāo)對(duì)療效的改善有積極意義[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)參與多種疾病的病理過(guò)程，其中微小RNA-532-3p(microRNA-532-5p，miR-532-3p)在腫瘤中起到了重要作用[4]。而有絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein-kinase，MAPK)級(jí)聯(lián)是調(diào)節(jié)增殖和應(yīng)激反應(yīng)等多種細(xì)胞過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)通路，在腫瘤血管生成中也具有重要作用[5]。但miR-532-3p、MAPK在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與患者靶向治療耐藥的相關(guān)性尚有待驗(yàn)證。本研究通過(guò)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者的血清miR-532-3p、MAPK水平，分析兩者與化療有效率及患者5年生存期的關(guān)系，旨在為靶向治療藥物的選擇提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2013年6月至2016年1月期間榆林市第一醫(yī)院腫瘤診療中心收治的30例EGFR基因突變非小細(xì)胞肺癌患者作為耐藥組，均為EGFR-TKIs耐藥患者，其中臨床分期Ⅲ期15例、Ⅳ期15例。EGFR-TKIs耐藥均為獲得性耐藥，即EGFR-TKIs治療有臨床獲益，但之后出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展。耐藥組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理結(jié)果顯示為非小細(xì)胞肺癌；(2)DNA測(cè)序證實(shí)為EGFR基因突變；(3)無(wú)其他部位腫瘤；(4)首次治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；(2)不能堅(jiān)持服藥者；(3)既往有肺部手術(shù)史者；(4)病情嚴(yán)重，且預(yù)計(jì)生存時(shí)間在1年內(nèi)者。選取同期于榆林市第一醫(yī)院腫瘤診療中心治療的非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKIs非耐藥患者32例為非耐藥組，其中臨床分期Ⅲ期21例、Ⅳ期11例。非耐藥組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理結(jié)果顯示為非小細(xì)胞肺癌；(2)無(wú)其他部位腫瘤；(3)首次治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)與耐藥組一致。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 藥物服用方法患者接受一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案，包括?？颂婺?、厄洛替尼、阿法替尼及吉非替尼，具體藥物的選擇依據(jù)患者病情進(jìn)行評(píng)估。

1.2.2 血清標(biāo)本采集于清晨利用采血管收集患者空腹外周靜脈血，每例5 mL，在4℃、3 000 r/min的離心機(jī)中離心，離心時(shí)間為15 min，分離血清，用于檢測(cè)血清miR-532-3p、MAPK水平。

1.2.3 血清miR-532-3p水平檢測(cè)以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法并按照試劑盒中的步驟檢測(cè)血清miR-532-3p水平。使用Trizol試劑(貨號(hào)：NR0002，北京雷根生物技術(shù)有限公司)從血清中抽提總RNA，合格標(biāo)準(zhǔn)為：吸光度A260/A280值在1.8~2.0之間，使用反轉(zhuǎn)錄試劑(貨號(hào)：k1622，北京蘭博康斯科技有限公司)將合格的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系20μL，其中正向和反向引物各2μL、cDNA 2μL、PCRMix 10μL、補(bǔ)水至20μL。反應(yīng)條件：95℃、10 min，95℃、15 s，72℃、15 s，共35個(gè)循環(huán)。通過(guò)比較Ct值并利用公式2-△△Ct計(jì)算miR-532-3p的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Table1 PCR primer sequence

1.2.4 血清MAPK水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)MAPK水平，絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶(MAPK)酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(貨號(hào)：ml122748，上海酶聯(lián)生物)，嚴(yán)格按照試劑盒方法操作。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]患者完全緩解(complete relief，CR)為治療后靶病灶完全消失，持續(xù)≥4周無(wú)新發(fā)病灶；患者部分緩解(partial relief，PR)為靶病灶縮小≥50%，且持續(xù)≥4周并無(wú)新發(fā)病灶；患者進(jìn)展(progressive disease，PD)為靶病灶增大≥25%或有新發(fā)病灶；患者穩(wěn)定(stable disease，SD)介于PR及PD之間。其中有效為CR、PR、SD例數(shù)之和，無(wú)效為PD。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法分析血清miR-532-3p、MAPK表達(dá)水平與5年生存期的關(guān)系；非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良的影響因素以Cox回歸模型進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較兩組患者的性別、年齡、吸煙史、肺癌類型、臨床分期、分化程度及服藥種類等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2和表3。

表2 兩組患者的性別、年齡以及吸煙史比較[±s，例(%)]Table 2 Comparison of gender,age,smoking history between the two groupsof patients[±s，n(%)]

表2 兩組患者的性別、年齡以及吸煙史比較[±s，例(%)]Table 2 Comparison of gender,age,smoking history between the two groupsof patients[±s，n(%)]

組別非耐藥組耐藥組χ2/t值P值例數(shù)32 30男15(46.88)14(46.67)女17(53.13)16(53.33)年齡(歲)60.45±5.46 60.26±5.17 0.140 0.889吸煙史10(31.25)13(43.33)0.969 0.325 0.000 0.987性別

表3 兩組患者的肺癌類型、臨床分期、分化程度及服藥種類比較[±s，例(%)]Table3 Comparison of type of lung cancer,clinical stages,degree of differentiation,and type of medication between thetwo groups of patients[±s，n(%)]

表3 兩組患者的肺癌類型、臨床分期、分化程度及服藥種類比較[±s，例(%)]Table3 Comparison of type of lung cancer,clinical stages,degree of differentiation,and type of medication between thetwo groups of patients[±s，n(%)]

腺癌15(46.88)14(46.67)0.023 0.989鱗癌10(31.25)9(30.00)腺鱗癌7(21.88)7(23.33)Ⅳ期11(34.38)15(50.00)1.552 0.213Ⅲ期21(65.63)15(50.00)高分化12(37.50)16(53.33)中低分化20(62.50)14(46.67)厄洛替尼6(18.75)8(26.67)阿法替尼7(21.88)5(16.67)吉非替尼9(28.13)6(20.00)埃克替尼10(31.25)11(36.67)1.203 0.752組別非耐藥組耐藥組χ2值P值例數(shù)32 30肺癌類型 臨床分期 分化程度 服藥種類1.567 0.211

2.2 兩組患者的血清miR-532-3p、MAPK水平比較與非耐藥組比較，耐藥組患者的血清miR-532-3p水平明顯升高，血清MAPK水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表4。

表4 兩組患者的血清miR-532-3p、MAPK水平比較(±s)Table4 Comparison of serum miR-532-3p and MAPK levelsbetween thetwo groupsof patients(±s)

表4 兩組患者的血清miR-532-3p、MAPK水平比較(±s)Table4 Comparison of serum miR-532-3p and MAPK levelsbetween thetwo groupsof patients(±s)

例數(shù)32 30組別非耐藥組耐藥組t值P值miR-532-3p 1.05±0.16 2.09±0.24 20.194 0.001 MAPK(mg/L)7.63±3.28 1.04±0.57 10.847 0.001

2.3 血清miR-532-3p、MAPK表達(dá)水平與化療客觀有效率的關(guān)系本研究以血清miR-532-3p水平(2.09)、MAPK水平(1.04)平均值為界，將患者分別分為miR-411-3p高、低表達(dá)組和MAPK高、低表達(dá)組?；?個(gè)周期(21 d為一個(gè)周期)后，miR-532-3p低表達(dá)患者治療有效率高于miR-532-3p高表達(dá)患者，MAPK低表達(dá)患者治療有效率低于MAPK高表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表5。

表5 血清miR-532-3p、MAPK表達(dá)水平與化療客觀有效率的關(guān)系(例)Table5 Relationship between theexpression levelsof serum miR-532-3p and MAPK and theobjectiveresponserateof chemotherapy(n)

2.4 血清miR-532-3p、MAPK表達(dá)水平與患者5年生存期的關(guān)系隨訪5年，非小細(xì)胞肺癌患者生存42例，死亡20例。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，血清miR-532-3p低表達(dá)患者5年累積生存率為84.4%，高于血清miR-532-3p高表達(dá)者的50.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=9.772，P＜0.05)；血清MAPK低表達(dá)患者5年累積生存率為61.3%，低于血清MAPK高表達(dá)者的74.2%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=1.969，P＞0.05)，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 血清miR-532-3p表達(dá)水平與患者5年生存期的關(guān)系Figure 1 Relationship between serum miR-532-3p expression and 5-year survival of patients

圖2 血清MAPK表達(dá)水平與患者5年生存期的關(guān)系Figure 2 Relationship between serum MAPK expression and 5-year survival of patients

2.5 影響患者預(yù)后不良的因素由于耐藥組患者的病例數(shù)較少，除本研究觀察指標(biāo)miR-532-3p、MAPK外，將臨床高度關(guān)注的臨床分期納入Cox回歸模型分析。結(jié)果顯示，MAPK低表達(dá)、miR-532-3p高表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌患者發(fā)生靶向治療耐藥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05)，見(jiàn)表6。

表6 Cox回歸模型分析影響非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良的因素Table 6 Cox regression model analysisof factorsinfluencing poor prognosisof patientswith non-small cell lung cancer

3 討論

肺癌患者由于早期出現(xiàn)的癥狀常不具有特異性，易錯(cuò)失手術(shù)機(jī)會(huì)，常需抗腫瘤藥物治療來(lái)延長(zhǎng)生存時(shí)間。EGFR基因突變患者常用靶向藥物(如埃克替尼、吉非替尼等)控制腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，獲得更長(zhǎng)的生存期。但治療過(guò)程中產(chǎn)生的耐藥性可影響藥物發(fā)揮作用[7]。因此，尋找能早期反映靶向治療耐藥性的輔助指標(biāo)，對(duì)治療方案的選擇及臨床療效的提高可能有幫助。

miR-532-3p已被證實(shí)在多種腫瘤中具有抑癌作用，且參與腫瘤耐藥的發(fā)生。miR-532-3p通過(guò)3'端非翻譯區(qū)的直接結(jié)合作用和對(duì)轉(zhuǎn)錄活性的間接抑制作用進(jìn)行調(diào)控[8]。Wang等[9]報(bào)道顯示，肝細(xì)胞癌組織中miR-532-3p的表達(dá)水平較高，miR-532-3p表達(dá)與腫瘤直徑、血管侵犯及TNM分期有關(guān)。而陳新華等[10]研究顯示，胃癌組織中miR-532-3p表達(dá)下調(diào)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān)，其表達(dá)變化與胃癌病情密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與非耐藥組血清miR-532-3p水平相比，耐藥組血清miR-532-3p水平升高，miR-532-3p低表達(dá)患者治療有效率高于miR-532-3p高表達(dá)患者，與Wang等[9]研究類似，提示miR-532-3p表達(dá)升高與EGFR-TKIs靶向治療耐藥有關(guān)，且miR-532-3p表達(dá)可作為評(píng)估患者化療療效的指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清miR-532-3p低表達(dá)非小細(xì)胞肺癌患者具有更高的5年累積生存率，考慮可能與化療3個(gè)周期后，血清miR-532-3p低表達(dá)患者治療有效率較高有關(guān)。

MAPK級(jí)聯(lián)是調(diào)節(jié)包括細(xì)胞增殖、分化和應(yīng)激反應(yīng)在內(nèi)的基本過(guò)程的中心信號(hào)元件，可通過(guò)連續(xù)激活三到五層蛋白激酶來(lái)傳遞信號(hào)，MAPK通路在腫瘤生成及轉(zhuǎn)移中具有重要作用[11]。有研究顯示，MAPK通路參與調(diào)節(jié)肺癌、胃癌等癌癥患者化療藥物的耐藥性[12]。江雪蓮等[13]研究報(bào)道，MAPK/ERK信號(hào)通路的活化形式與卵巢癌細(xì)胞的增殖及凋亡有關(guān)，抑制該信號(hào)通路對(duì)臨床治療卵巢癌有幫助。本研究中，EGFR-TKIs耐藥患者血清MAPK水平顯著低于EGFR-TKIs非耐藥患者，且MAPK高表達(dá)者治療有效率為70.97%，較MAPK低表達(dá)者高，提示MAPK表達(dá)降低可能參與耐藥性的發(fā)生，且檢測(cè)MAPK表達(dá)可能對(duì)評(píng)估患者化療療效有積極意義。本研究生存分析還發(fā)現(xiàn)，血清MAPK高表達(dá)非小細(xì)胞肺癌患者5年累積生存率雖高于血清MAPK低表達(dá)患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。今后需擴(kuò)大研究對(duì)象繼續(xù)探討MAPK與患者長(zhǎng)期預(yù)后的關(guān)系，以得到可靠結(jié)論。最后本研究多因素Cox回歸模型分析顯示，miR-532-3p高表達(dá)、MAPK低表達(dá)均與靶向治療耐藥的發(fā)生獨(dú)立相關(guān)，提示miR-532-3p表達(dá)上調(diào)及MAPK表達(dá)下調(diào)可能促進(jìn)患者發(fā)生靶向治療耐藥，但具體機(jī)制尚需補(bǔ)充相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，非小細(xì)胞肺癌患者血清miR-532-3p水平升高及MAPK水平降低與EGFR-TKIs耐藥有一定關(guān)系，兩者均可作為評(píng)估EGFR-TKIs耐藥的血清指標(biāo)，且與患者預(yù)后密切相關(guān)。