醋酸鉛誘導心肌細胞凋亡的機制研究

張藍心，李欣，楊丹，鄧楊，李登位

1.南充市第四人民醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000；

2.南充市中心醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000

鉛暴露是全世界最重要的公共衛(wèi)生問題之一。由于具有優(yōu)異性能的含鉛材料應用于如光伏、化工、日化和醫(yī)療等多個領(lǐng)域，使得人類持續(xù)暴露于含鉛的環(huán)境中[1-3]。重要的是，鉛可通過呼吸道、皮膚和胃腸道進入人體，經(jīng)血液循環(huán)到達全身各組織器官，從而對重要臟器造成損傷[4]。而心臟作為人體最重要的器官之一，其主要組成單位心肌細胞僅具有極其有限的再生能力，一旦遭受損傷有可能導致心肌永久性缺失，從而影響心臟功能[5]。因此探討鉛誘導的心肌損傷具有重要意義。

據(jù)報道，當鉛蓄積在心肌組織時，主要通過誘導大量心肌細胞凋亡，從而影響心臟功能[6]。眾所周知，凋亡是最重要也是最常見的細胞死亡形式之一，主要存在三大基本途徑：線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑，其中線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑稱為內(nèi)源性途徑，而死亡受體途徑被稱為外源性途徑。目前，研究已經(jīng)表明鉛中毒將誘發(fā)過度氧化應激，從而導致線粒體損傷，最終引起細胞凋亡的發(fā)生[7]。有趣的是，過度氧化應激產(chǎn)生的大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及能量代謝危機所致的鈣失衡可能誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激將進一步加重氧化應激的發(fā)生和鈣調(diào)節(jié)紊亂，最終促使細胞走向凋亡[8]。然而，目前罕有研究去探索鉛暴露是否可通過誘發(fā)心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激從而誘導細胞凋亡，這使得研究者們難以從誘導凋亡的內(nèi)源性途徑整體上去理解鉛暴露誘導細胞凋亡的機制。因此，本研究將圍繞凋亡的內(nèi)源性途徑探討鉛誘導心肌細胞凋亡的具體機制，深入理解鉛暴露所致心肌損傷的病理過程。

1 材料與方法

1.1 材料AC16人心肌細胞來源于ATCC。Cell Counting Kit-8(CCK-8)、活性氧熒光探針(DCFH-DA)購自日本同仁化學研究所；胰酶細胞消化液(0.25%胰酶)、RIPA細胞快速裂解液、BCA試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、Calpain 1單克隆抗體、Caspase 3多克隆抗體、β-actin單克隆抗體、HRP酶標抗兔二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM、胎牛血清購自美國Thermofisher；Bip單克隆抗體、Cleaved-PARP單克隆抗體購自美國CST(Cell Signaling Technology)；醋酸鉛購自于北京伊諾凱科技有限公司。酶標儀、細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermofisher；低溫高速離心機購自德國Eppendorf；曝光機購自美國Azure Biosystems；電泳儀購自美國BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)AC16細胞復蘇后，使用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到80%~90%時，按照1∶(3~4)的比例傳代3次后進行實驗，所有細胞均隨機分為正常對照組和不同濃度的醋酸鉛組。

1.2.2 CCK-8細胞活性檢測制備AC16細胞懸液，細胞密度為7×103個/孔，100μL/孔接種到96孔板，放置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別設正常對照組和不同濃度醋酸鉛組(濃度分別為：3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h。然后每孔加入CCK-8液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h后取出，用酶標儀(450 nm)檢測各組細胞的吸光值(OD值)。

1.2.3 LDH釋放檢測制備AC16細胞懸液，細胞密度為7×103個/孔，100μL/孔接種到96孔板，放置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別設正常對照組和不同濃度醋酸鉛組(濃度同上)，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h。然后將細胞培養(yǎng)板用多孔板離心機400×g離心5 min。分別取各孔的上清液120μL，加入到一新的96孔板相應孔中，隨即按照說明書進行樣品測定。

1.2.4 細胞內(nèi)ROS水平檢測檢測經(jīng)過不同濃度(50μg/mL、100μg/mL)醋酸鉛處理的AC16細胞產(chǎn)生的ROS水平。按2×105個/孔在普通小皿中接種AC16細胞，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h后，將醋酸鉛與細胞進行共孵育，同時設置正常對照組，待再次培養(yǎng)6 h后，用染核試劑和ROS熒光探針對細胞進行探針裝載。然后在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生情況。

1.2.5 線粒體膜電位檢測檢測經(jīng)過不同濃度(50μg/mL、100μg/mL)醋酸鉛處理的AC16細胞線粒體膜電位變化。按2×105個/孔在普通小皿中接種AC16細胞，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h后，將醋酸鉛與細胞進行共孵育，同時設置正常對照組，待再次培養(yǎng)6 h后，按照說明書用線粒體膜電位熒光探針JC-1處理細胞。然后在熒光顯微鏡下觀察細胞線粒體膜電位變化情況。

1.2.6 Western Blot檢測經(jīng)過不同濃度(50μg/mL、100μg/mL)醋酸鉛處理的AC16細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和凋亡相關(guān)蛋白表達的改變。按8×105個/孔在普通大皿中接種AC16細胞，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h后，將醋酸鉛與細胞進行共孵育，同時設置正常對照組，待再次培養(yǎng)12 h后移除培養(yǎng)液，用冰PBS洗一遍，加入適量RIPA裂解液，置于搖床冰上，裂解15 min，用細胞刮充分刮數(shù)下，收集蛋白至EP管，采用BCA法進行的蛋白定量。各組樣本取相同適量蛋白進行SDS-PAGE電泳(初始電壓為80 V，待蛋白條帶入分離膠，調(diào)整電壓至120 V)，預先將PDVF膜泡在甲醇液中30~60 s，待電泳結(jié)束，將其轉(zhuǎn)印至PVDF膜，趕走膜和膠之間的氣泡，放入轉(zhuǎn)膜槽(90 V，90 min)，1×TBST稀釋的5%脫脂牛奶，搖床上常溫封閉1.5 h。將一抗和膜置于孵育盒中共同孵育(一抗稀釋液配制所有的一抗，濃度為1∶1 000)，4℃搖床過夜。回收一抗，1×TBST洗膜3次，15 min/次。二抗用1×TBST稀釋的5%脫脂牛奶溶解，與膜在搖床上常溫孵育1.5 h。1×TBST洗膜3次，15 min/次，隨即進行顯色及曝光。采用ImageJ對Western blot條帶進行量化，將歸一化后目標蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值之間比值視為目標蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS20.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)表示，多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA test)，組間多重比較采用最小顯著性差異法(LSD法)檢驗；組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞毒性作用檢測醋酸鉛對細胞存活率和LDH釋放以明確醋酸鉛對AC16的細胞毒性。如圖1所示，當≥25μg/mL醋酸鉛處理24 h后，細胞存活率較正常對照組明顯下降且具有濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時隨著醋酸鉛的濃度增高，培養(yǎng)液中LDH的濃度成梯度增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 不同濃度醋酸鉛處理后，AC16心肌細胞存活率和LDH釋放情況Figure 1 The viability and LDH release of AC16 cardiomyocytes after treatment with different concentrationsof lead acetate

2.2 ROS蓄積和線粒體損傷基于上述結(jié)果，選擇適當暴露濃度(50μg/mL、100μg/mL)進一步驗證醋酸鉛經(jīng)線粒體途徑誘發(fā)細胞凋亡。通過熒光探針標記ROS以及反應線粒體膜電位變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)醋酸鉛處理后，心肌細胞胞內(nèi)ROS水平相較于正常對照明顯升高，從而造成線粒體損傷、膜電位下降，引起能量衰竭，進而使得ROS水平進一步上升(圖2)。

圖2 不同濃度醋酸鉛處理后AC16細胞內(nèi)ROS水平和線粒體膜電位的變化Figure2 Changesof ROSlevels and mitochondrial membranepotential in AC16 cellstreated with different concentrationsof lead acetate

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激為進一步理解醋酸鉛所致AC16心肌細胞的損傷機制，通過Western blotting檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和凋亡的關(guān)鍵蛋白。結(jié)果顯示，相較于正常對照組，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的感受器蛋白Bip和通路關(guān)鍵蛋白Calpain 1表達均明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時發(fā)現(xiàn)醋酸鉛處理后AC16的凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP較正常對照組表達均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖3~圖5。

圖3 Western blotting檢測醋酸鉛處理后AC16細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白Calpain 1和Bip蛋白和凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP的表達Figure 3 Western blotting was used to detect the expressions of endoplasmic reticulum stress-related proteins Calpain 1 and Bip proteins and apoptosis-related proteins Cleaved-caspase3 and Cleaved-PARP in AC16 cells after lead acetatetreatment

圖4 不同濃度醋酸鉛處理后AC16細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白Bip和Calpain 1蛋白的相對表達量Figure 4 The relative expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins Bip and Calpain 1 in AC16 cells treated with different concentrationsof lead acetate

圖5 不同濃度醋酸鉛處理后AC16細胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP和Cleaved-caspase3的相對表達量Figure 5 The relative expression of apoptosis-related proteins Cleaved-PARP and Cleaved-caspase3 in AC16 cells treated with different concentrationsof lead acetate

3 討論

鉛是廣泛存在的工業(yè)污染物，進入人體后經(jīng)血液循環(huán)蓄積在全身各組織器官，通過干擾細胞的各種生理、生化過程，造成多組織器官損傷，尤其是鉛中毒誘導的心肌損傷受到廣泛關(guān)注。研究表明，鉛暴露對心臟組織產(chǎn)生毒性作用，可導致心臟功能受損[9]。隨后的研究也發(fā)現(xiàn)鉛暴露與心臟組織損傷程度、血清LDH活性水平和肌酸激酶同工酶濃度相關(guān)，表明鉛暴露會導致心臟毒性[10]。近年臨床研究也揭示了血鉛水平與左心室每博輸出量和射血分數(shù)呈負相關(guān)[11]。同時，前瞻性研究發(fā)現(xiàn)左心室的收縮能力隨著鉛暴露而下降[12]。這些不利影響最終可能導致心力衰竭，嚴重威脅人類生命安全。因此鉛暴露所引起的心臟疾病的防治是迫切需要解決的問題，那么探索鉛暴露所致心肌損傷的機制可能為鉛中毒的防治提供新的思路。

為此，本研究選用人源心肌細胞AC16建立體外研究模型，首先通過經(jīng)典的CCK-8實驗和乳酸脫氫酶的釋放明確鉛化合物的心肌細胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露會顯著降低細胞的存活率，同時設置不同暴露濃度，明確了醋酸鉛致心肌細胞毒性的量-效關(guān)系。這將為鉛暴露的防治提供重要的基礎數(shù)據(jù)，也為下一步機制探索提供依據(jù)。

基于上述結(jié)果，本研究選擇合適的鉛暴露濃度探索毒性損傷機制。目前普遍認為鉛具有誘發(fā)氧化應激的能力，近年來的研究也揭示氧化應激在鉛中毒的病理過程中的作用[13-15]。因此，通過檢測ROS水平的變化，揭示了鉛暴露后AC16細胞內(nèi)ROS水平明顯升高，提示鉛可誘導氧化應激的發(fā)生。同時由于鉛對巰基(-SH)具有高的親和力，與-SH形成硫醇鹽，抑制氧化還原體系中酶的活性，進一步破壞氧化還原的調(diào)節(jié)能力[16]。這一過程也將加劇氧化應激的程度，從而嚴重影響細胞的生理活動，還使得細胞各種成分受到破壞。本次研究也發(fā)現(xiàn)，鉛暴露后細胞內(nèi)線粒體膜電位明顯下降，提示ROS水平持續(xù)升高使得線粒體受到損傷。當線粒體膜完整性受到損害時，細胞色素C釋放到胞質(zhì)中，從而誘發(fā)細胞凋亡[17]。

為了明確細胞凋亡的發(fā)生，檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達改變。研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露誘導AC16心肌細胞凋亡蛋白Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP表達明顯增加，證明了鉛誘導心肌細胞凋亡的發(fā)生。但是，凋亡的內(nèi)源性途徑主要有兩條，分別為線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。當細胞受到刺激時，不僅引起氧化應激和線粒體損傷，還使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中積累未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，這會激活未折疊蛋白質(zhì)反應(UPR)，從而影響細胞的存活[18]。然而目前鮮有研究探索鉛暴露是否會影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。為此，繼續(xù)深入分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激感受器蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)Bip蛋白明顯升高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生。重要的是，研究還發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白Calpain1表達增加，這不僅證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，還提示Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放到胞質(zhì)中。而Ca2+被線粒體吸收，通過不同的機制進一步促進線粒體產(chǎn)生ROS和細胞色素C的釋放，進而誘導氧化應激并損害線粒體功能，最終導致細胞死亡[19]。因此，本次研究發(fā)現(xiàn)線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑在鉛暴露誘導心肌細胞凋亡中具有重要協(xié)同作用，不僅加深對毒性損傷機制的理解，有助于為疾病的防治提供基礎理論。

綜上，本研究通過體外模型明確了鉛暴露會造成心肌細胞損傷。同時首次初步闡明鉛誘發(fā)心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，揭示其與氧化應激和線粒體損傷在鉛暴露所致心肌細胞凋亡的協(xié)同效應。這為全面理解鉛所致毒性損傷機制提供新的依據(jù)，有助于拓展該疾病的治療策略。然而，本次研究仍然存在一些不足之處，一方面是對機制的探索有待進一步深入，另一方面是未通過體內(nèi)模型進行研究。為此，接下來的工作將建立體內(nèi)模型，深入挖掘鉛暴露損傷機制和特點，力爭為鉛暴露所致心血管疾病的防治提供新思路。