基于高密度培養的阿維菌素發酵工藝優化

劉進峰，程 曦，劉麗虹，高亞琪，王學偉，王習琢

(1.河北興柏農業科技有限公司，河北省阿維菌素生物技術重點實驗室，石家莊 051530；2.石家莊市農業技術推廣中心，石家莊050000)

高密度指菌體生物量大于60 g/L，其培養方式多應用于菌體的生產和初級代謝產物為目標產物的發酵生產[1]。而阿維菌素作為阿維鏈霉菌的次級代謝產物，菌體密度較低，通過菌種改良、配方優化和控制工藝調整，阿維菌素發酵生產水平已得到大幅提高，特別是隨著合成生物學的興起，中科院微生物研究所與河北興柏農業科技有限公司等利用基因編輯技術，采用“5M”策略[2]，對阿維鏈霉菌菌種進行的定向改造，構建的主產B1a菌株應用于阿維菌素工業化生產，平均發酵效價達7 000μg/mL，該成果也因此獲得2016年國家科技進步二等獎[3]。比較大生產和實驗室2種發酵狀態生化參數發現，實驗室生物量及其發酵效價可分別高達52~55 g/L和8 000~9 000 μg/mL，但工業化生產生物量僅46~48 g/L，發酵效價僅7 000μg/mL。大生產發酵效價難以達到其實驗室水平，且為實現最大效益，工業化生產還需考慮發酵過程中的能源節約。盡管生物量大只是效價高的必要但不充分條件，但工業化生產過程中，仍有必要通過發酵配方的調整增加阿維鏈霉菌的生物量。不過，生物量的增加意味著與之對應的攪拌轉速、風量等控制參數的調整，否則，可能出現因溶氧不足或質能傳遞障礙，進而導致發酵代謝異常而達不到提高效價的目標。

本文基于比較2種狀態下的生物量、發酵效價，通過發酵配方的調整，增加工業化生產的生物量，調整優化與之對應的發酵控制參數，以達到提高發酵效價，增加企業效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)AVX-09，河北興柏農業科技有限公司。

1.1.2 儀器

SW-CJ-2G超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；TS-211B臥式恒溫搖床(無錫瑪瑞特科技有限公司)；P-230高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)；DHG-9023A電熱恒溫干燥箱(上海環竟試驗設備廠)。

1.1.3 發酵罐

120 m3碳鋼發酵罐由江蘇揚州永鋒工業設備安裝有限公司制作，裝配有3層攪拌器，最下層攪拌器HY(CD-6)為徑向流式半圓管結構，中上層攪拌器KSX(A-315)為軸向流式。最下層攪拌器直徑1.23 m，中間和上層攪拌器直徑1.35 m，攪拌器間距2.55 m，罐高9.22 m，罐直徑3.82 m。

1.2 培養基及培養條件

1.2.1 搖瓶發酵培養基

質量濃度分別為淀粉170~178 g/L，熱軋黃豆餅粉28~32 g/L，酵母粉6~10 g/L，玉米漿2~6 g/L，輕質碳酸鈣1.2~1.6 g/L，淀粉酶質量分數0.025%。搖瓶裝量：250 mL三角瓶裝量40 mL，接種量：2~4 mL。

搖瓶培養條件：溫度27~28℃，轉速250 r/min，培養時間10~12 d。

1.2.2 50 L發酵罐培養基及培養條件

質量濃度分別為淀粉172 g/L，熱軋黃豆餅粉25 g/L，酵母粉10 g/L，玉米漿3 g/L，輕質碳酸鈣1.6 g/L，淀粉酶質量分數0.025%。消后體積32~35 L，接種量：8%~10%。

搖瓶培養條件：溫度27~28℃，攪拌轉速400~600 r/min，風量1.0~1.2 L/(L·min)，培養時間14~16 d。

1.2.3 種子罐(12 m3)培養基

質量濃度分別為淀粉20 g/L，熱軋黃豆餅粉5 g/L，酵母粉5 g/L，花生粉5 g/L，氯化鈷10 mg/L；消后體積8~9 m3、pH 7.5~8.0。

培養條件：溫度28~29℃，空氣流速400~600 m3/h，培養時間2~3 d。

1.2.4 大生產(120 m3)發酵培養基

質量濃度分別為淀粉174~178 g/L，熱軋黃豆餅粉28~32 g/L，酵母粉10 g/L，玉米漿2 g/L，輕質碳酸鈣1.6 g/L，淀粉酶質量分數0.025%。消后體積92~94 m3，接種量：6~8 m3。

搖瓶培養條件：溫度27~28℃，攪拌頻率35~48 Hz，風量2 600~3 100 m3/h，培養時間14~16 d。

1.3 測定方法

1.3.1 生物量測定

精確量取50 mL發酵液加入至250 mL三角瓶中，再添加適量助濾劑。于水浴鍋中升溫至約95℃，維持3~5 min，抽濾得濾餅，適量熱水洗，102℃烘干到恒重，降溫稱量(W2)，生物質量濃度的計算公式為：

式中：20為換算系數，W1為助濾劑質量，W0為濾布質量。

1.3.2 B1a效價測定

精確量取2 mL發酵液，加入到50 mL容量瓶中，添加適量甲醇至規定位置，超聲浸取10~20 min，甲醇定容、過濾待用。

HPLC系統：色譜柱C18(4.6 mm×250 mm)，柱溫30℃，流動相甲醇∶水=9∶1(體積比)，流速1.0 mL/min，測量用波長246 nm，進樣量20 μL，記錄測量的峰面積，外標法計算B1a效價的公式為：

2 結果與討論

2.1 實驗室和工業化生產發酵效價、生物量

阿維菌素是典型的菌體生長與產物合成非偶聯型發酵的產物[4]。作為一種次級代謝物，其產素時間和產素速率對合成反應時的環境高度敏感，當阿維鏈霉菌菌體濃度較高時，發酵液黏度明顯增加，這有別于細菌的發酵。實驗室與工業化生產的反應器容積大小不同，控制參數有區別。長期觀察2種發酵過程發現，工業化生產狀態下的效價和生物量均低于其實驗室水平。圖1數據顯示，實驗室50 L發酵狀態下，發酵效價增長迅速，放罐時效價和生物量分別達8 327μg/mL和53.6 g/L；而工業化生產狀態下，放罐時效價和生物量僅分別為7 136μg/mL和47.2 g/L(圖1)。

圖1 實驗室與工業化生產發酵效價與生物量

提高發酵效價的途徑，首先是構建高產菌株，增加單位體積菌株的B1a合成能力；其次，通過對發酵過程的代謝調控，如通過補料等延緩菌體衰老以提高合成速率和延長阿維鏈霉菌的產抗時間，進而提高發酵放罐效價；再次，菌株產能一定的情況下，通過增加單位菌體的數量，進而提高發酵效價，也不失為一種提高發酵效價的途徑。

2.2 發酵配方

2.2.1 發酵配方的優化

作為生物參數，生物量同黏度、pH等理化參數一樣，與培養基配方密切相關，并對發酵效價有重要影響。阿維菌素發酵周期長達15 d，發酵配方中碳源含量相對較高，淀粉主要作為能量物質為阿維鏈霉菌中后期生物合成阿維菌素提供能量，而氮源主要用于構成菌體的細胞物質，對生物量有更大影響[5]。生物量增加，需要增加氮源，同時，與之對應的碳源數量也需調整。為此，對黃豆餅粉、玉米漿、酵母粉和淀粉4個因素按表1設計了L9(34)正交試驗(表2)，確定最優水平組合。結果顯示，在設計水平內，根據k值大小，最優水平組合為A3B3C1D1，即氮源分別為黃豆餅粉32 g/L、酵母粉10 g/L、玉米漿2 g/L時，對應碳源淀粉的質量濃度為178 g/L。根據極差(R)大小，4個因素對發酵效價影響的大小順序為淀粉＞黃豆餅粉＞酵母粉＞玉米漿。

表1 正交設計因素水平表

表2 L9(34)正交試驗

2.2.2 驗證試驗

由于正交試驗得到的最優方案不在試驗序列中，需將優化后的方案A3B3C1D1與第8號A3B2C1D3試驗做搖瓶發酵對照比較。將培養好的種子液接入不同配方的試驗組和對照組，每組接3瓶。結果(平均值±標準差)為試驗組效價=(8 536±179)μg/mL，對照組效價=(8 227±213)μg/mL，試驗組較對照組高3.8%，且發酵效價波動小，即試驗得到的配方為最優方案。2種方案盡管碳源、氮源總量均相同，但與第8號試驗相比，最優方案的玉米漿數量少，黃豆餅粉數量多，說明玉米漿在發酵配方中添加量不宜過多。玉米漿富含氨基酸，更多的以速效氮源的形式體現，添加量過多時，容易引起菌絲“瘋長”，發酵液黏度高，影響氧的傳遞，進而影響到初級代謝向次級代謝轉化的進程，延長穩定期，縮短產素期，最終影響放瓶效價。

2.3 控制參數的優化

了解和掌握發酵工藝條件對發酵過程的影響，以及微生物代謝過程的變化規律，可以有效地控制微生物的生長和代謝產物的生成，提高發酵生產水平。微生物發酵體系是個復雜的多相共存動態系統，此系統中，微生物細胞同時進行著上千種不同的生化反應，它們之間既相互促進，又相互制約，任何培養條件的微小變化都有可能對發酵的生產能力產生較大影響。當培養基濃度增加時，除了生物量增加外，還會因細胞中原生質飽滿，引起菌絲剛性增加，導致發酵液流變特性的變化[6]。即發酵液黏度增加，進而影響質量和能量傳遞，為此，有必要對攪拌頻率和風量調整優化。以放罐效價為指標，對發酵培養比較關鍵的時間段(100 h之前)攪拌頻率和風量設計了雙因素有重復試驗(表3)。結果顯示，最高效價達8 183μg/mL；當攪拌頻率為48 Hz、風量為3 100 m3/h時，平均發酵效價最高達8 007μg/mL，且相對于攪拌頻率45 Hz，放罐效價波動更小。阿維菌素工業化生產實踐表明，風量與攪拌頻率宜協調控制。例如，發酵生產過程偶爾會出現發酵培養中后期，因攪拌聯軸器故障而不能運轉，被迫將風量調至最大，但發酵效價的增長仍較慢，放罐時效價較正常罐批低500μg/mL以上。因為攪拌的目的是增加壓縮空氣在發酵液中的滯留時間，特別是下層攪拌器主要功能是將進入發酵罐底部的壓縮空氣分散均勻。所以，當前發酵罐普遍使用軸向流的LIGHGTIN A315和CD-6組合式攪拌器，就是為了更好地增加壓縮空氣在發酵液中的滯留時間，以保證發酵培養過程溶解氧供應[7]。

表3 雙因素有重復試驗

為更深入研究攪拌頻率、風量對發酵效價的影響，對表3數據做方差分析(表4)。結果顯示，在設計水平內，攪拌頻率P值=0.002＜0.01，即攪拌頻率對發酵效價有非常顯著影響；風量P值=0.014＜0.05，即風量對發酵效價有顯著影響；攪拌頻率與風量的交互作用P值=0.860，即交互作用對發酵效價的影響不顯著，統計分析結果能較好吻合生產實踐。

表4 方差分析

2.4 工業化生產驗證

菌體生長與產物合成非偶聯型發酵產品，其產物合成速率與菌體的比生長速率無直接關系，但和生物量有關[8]。微生物的生長繁殖離不開各種營養物質，且在一定范圍內，基質濃度越高，生長繁殖越快，生物的質量濃度也越高，同時合成目標產物所需的條件也越苛刻。將優化后的配方、攪拌頻率、風量等控制參數在120 m3發酵罐上反復驗證、對比，同時考慮能耗、生產穩定性等因素，確定了主要原材料配比為黃豆餅粉32 g/L、酵母粉10 g/L、玉米漿2 g/L、淀粉178 g/L，100 h前攪拌頻率48 Hz、風量3 100 m3/h。連續罐批生產驗證結果(圖2)顯示，平均放罐生物量52.3 g/L，效價7 709μg/mL，較原工藝分別提高12.3%和8.0%。值得注意的是，最高效價7 968μg/mL，其生物量53.6 g/L并不是最高生物量53.8 g/L，可能與生物量的測定方法有關，本法不能消除死亡菌絲體對測定結果的影響。發酵培養過程多種偶然因素可能導致不同罐批，其菌體新陳代謝狀況不同，但生物量大于53 g/L罐批的平均放罐效價7 803μg/mL高于生物量為52 g/L罐批的平均放罐效價7 639μg/mL。

圖2 工業化生產放罐效價與生物量

3 結 論

代謝產物的合成是靠菌(生產者)來完成的。菌量越多，產量要越大，其條件是菌的生產力能保持在最佳狀態和具備適宜生產條件，包括產物合成所需的足夠基質、前體、誘導物等和沒有有害代謝物積累。要滿足這些條件并不容易，因為生物量增加后，會引起菌絲形態的變化和原生質飽滿引起的菌絲剛性的變化，這些都會對發酵液的黏度造成重大影響，進而影響Kla。為此，必要對發酵罐攪拌系統重新設計，如改變攪拌器尺寸、增加攪拌器層數等，引起能耗的增加，甚至增加其他生產風險，尤其是對于合成環境敏感的次級代謝產物的發酵生產。而阿維鏈霉菌的發酵特性表現為，發酵培養100 h后非牛頓流體性質減弱，料液膨脹稀化，泡沫增多，發酵液黏度減小[9]，這些都有利于高密度培養。

根據工業化生產狀態下阿維鏈霉菌的發酵特征，基于高密度培養而對發酵配方及工藝控制條件進行優化，平均發酵效價可提高8.0%以上，達7 709μg/mL。研究結果對次級代謝產物的發酵生產，適度實施高密度培養，有借鑒價值。