基于二茂鐵標記適配體的電化學傳感器檢測玉米中黃曲霉毒素B1

朱冠宇，朱成喜，李玉葉，陳立興，韓曉新

（1.江蘇理工學院 電氣信息工程學院，江蘇 常州 213001；2.江蘇大學 農業工程學院，江蘇 鎮江 212013）

黃曲霉毒素B1（AFB1）是一種常見真菌毒素，主要由黃曲霉和寄生曲霉等霉菌產生，廣泛存在于發霉的谷物及其制品中[1]。作為最危險的生物污染物之一，AFB1對人類具有強致癌性，被國際癌癥研究機構（IARC）列為1類致癌物，已嚴重威脅到人類健康。AFB1在農產品和食品中被頻繁檢到，從而引起了全球關注[2]，因此，發展簡便、靈敏、快速的AFB1檢測技術對保障農產品和食品質量安全至關重要。目前，AFB1的檢測方法主要有薄層色譜法[3]、高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS）[4]、酶 聯 免 疫 法[5]、熒 光分析法[6]等。例如，Andrade等人[7]利用低溫液-液微萃取技術構建的HPLC和熒光光譜相結合的傳感平臺，可實現對牛奶中AFB1低至5 pg/mL的靈敏檢測。利用上述分析技術可以實現對真菌毒素靈敏、可靠的檢測，但是需要專業的操作人員，且儀器昂貴、分析成本高，因此難以在基層實驗室或快速檢測現場推廣使用[8]。

電化學傳感技術是一種利用待測物電化學性質，通過建立電信號與被測物濃度之間的線性關系進行檢測的方法。與前述方法相比，電化學方法具有儀器簡單、響應快、靈敏度高等優點，為構建新型真菌毒素檢測方法提供了良好的基礎[9-10]。傳統的電化學傳感器主要利用待測物在修飾材料的電極表面發生氧化還原反應的特性，根據產生的電流大小檢測目標物濃度，體系的選擇性較差[11]。為了提高電化學傳感器的靈敏度和選擇性，研究人員對適配體開展了深入的研究。適配體是一種人工合成的單鏈DNA或RNA，對靶標具有高特異性親和力。適配體的結構多樣，可形成發夾、假結、凸環、G-四聯體等復雜空間結構，與目標分子發生類似抗原-抗體反應的構象識別[12]。相較于抗體，除了親和力高、特異性強等特點外，適配體還具有靶標范圍廣、篩選周期短、成本低、穩定性好、便于修飾等優點。利用適配體作為識別元件的電化學傳感器，可以獲得更高的檢測靈敏度和選擇性，在真菌毒素檢測領域具有巨大應用潛力[13]。

在電化學適配體傳感策略中，為了獲得針對目標物的電響應信號，往往需要加入與DNA（適配體）或納米材料有特殊親和力的電活性小分子作為氧化還原探針，如亞甲基藍（MB）、二茂鐵（Fc）、硫堇（Thi）等[14-15]。利用電化學探針標記適配體或互補DNA，通過目標誘導電極表面DNA的構象變化，改變探針與電極表面的距離（距離調控策略），或目標物加入后產生的位阻變化，導致探針電化學特征的變化（位阻效應策略），實現目標物的電化學適配體傳感[16]。Yuan等人[17]利用互補DNA與Thi修飾DNA/AuNPs納米復合物來放大Thi的電流信號，構建的電化學適配體傳感器對miRNA的檢出限低至11 amol/L。上述研究為檢測AFB1提供了新的、有效的方法和途徑。

本文提出了一種基于二茂鐵標記適配體的電化學適配體傳感器，用于靈敏檢測玉米中的AFB1。該傳感器通過在金電極上順序組裝巰基化互補DNA（cDNA）、巰基己醇（MCH）、二茂鐵修飾AFB1適配體（Fc-Apt）形成基于雙鏈DNA結構的傳感界面。當AFB1存在時，其與適配體的特異性結合導致Fc-Apt從電極上釋放，使IFc降低，從而實現對AFB1的靈敏檢測。該傳感器具有較高的靈敏度和選擇性、良好的重現性和穩定性，可成功應用于對玉米中AFB1的檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與藥品

氯化鉀、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀（均為國藥試劑）；6-巰基己醇（Adamas公司）；羥甲基氨基甲酸（Tris）（Alfa Aesar公司）；黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2（AFB2）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和伏馬菌素B1（FB1）（均為Aladdin試劑）。本研究所用的試劑均為分析純，所用水均為超純水。適配體和DNA鏈由生工生物公司提供，序列如表1所示。

表1 適配體和DNA鏈的序列

1.2 儀器設備

所有電化學測量，包括循環伏安（CV）、交流伏安（ACV）、電化學阻抗譜（EIS），均在CHI660E電化學工作站（上海辰華）進行。

1.3 電化學測量

所有的電化學測量均在室溫下使用三電極體系進行。以鉑絲為對電極，Ag/AgCl（飽和KCl）為參比電極，金電極（AuE，直徑3 mm）為工作電極。EIS測量是在含有5 mmol/L Fe（CN）63-/4-的0.1 mol/L KCl中進行，頻率范圍為0.1 Hz～10 kHz，直流電壓為0.25 V。使用ZSimpWin軟件基于Randles等效電路，對阻抗數據進行擬合。ACV測量是在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中進行，掃描電位為0.2～0.7 V、階躍電位為4 mV、頻率為25 Hz、振幅為25 mV。

1.4 傳感器的構建及檢測機理

該傳感器的構建過程如圖1所示，步驟如下：首先，將6 μL的cDNA溶液滴加到Au電極上，室溫下放置6 h，使cDNA通過Au-SH鍵組裝在AuE電極表面；其次，將所得電極在1 mmol/L的MCH中浸泡1 h，以阻斷Au的特異性結合位點；然后，滴 加6 μL的Fc-Apt溶 液，孵 育1 h，利 用DNA雜交將Fc-Apt組裝于電極表面，用Tris-HCl緩沖液洗滌后，得到AFB1適配體傳感器，記為AuE/cDNA/MCH/Fc-Apt。

圖1 電化學AFB1適配體傳感器的構建和檢測示意圖

為了檢測AFB1，將上述傳感器浸泡在AFB1溶液中孵育一定時間，然后用Tris-HCl緩沖液洗滌后進行ACV測量。ACV測量過程如下：以上述洗滌后的電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl（飽和KCl）為參比電極，在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，以掃描電位0.2～0.7 V、階躍電位4 mV、頻率25 Hz、振幅25 mV進行ACV測量。傳感器的檢測機理如下：目標物AFB1加入后，其與適配體的特異性識別導致Fc標記適配體（Fc-Apt）從電極表面剝離，隨著Fc在電極表面吸附量的降低，Fc的氧化電流（IFc）降低；通過測量標準濃度AFB1溶液的電流信號IFc，建立AFB1濃度對應IFc的標準線性曲線；將所測得的IFc代入標準線性曲線，實現對AFB1的電化學靈敏檢測。

1.5 實際樣品處理

玉米樣品采購自本地超市（江蘇常州）。樣品的處理過程如下[18]：首先，玉米經粉碎機粉碎后，加入一定量的AFB1標準溶液，室溫下干燥6 h；其次，將10 mL甲醇-水混合液（體積比6∶4）添加到處理過的樣品中，震蕩2 h后，以8 000 rpm將混合物離心10 min，上清液使用過濾器（0.22 μm）過濾；最后，用Tris-HCl緩沖液將所得溶液稀釋為1、2、5、10 ng/mL四個樣本，并在4℃冰箱中保存備用。

2 結果與討論

2.1 傳感器的電化學表征

使用EIS技術對AFB1傳感器的構建和目標識別過程進行了研究。EIS結果用Nyquist圖表示，并使用Randles等效電路進行了擬合，見圖2。擬合參數包括電解質溶液電阻（Rs）、常相角元件（Q）、電荷轉移電阻（Ret）和擴散電阻（Zw）。其中，Ret反映了氧化還原探針在電極界面的電荷轉移動力學，其阻值可以通過計算Nyquist圖的半圓直徑來估算。如圖2所示，Au電極的Ret值（曲線a）為90 Ω，表明其良好的導電性。隨后，cDNA/AuE的Ret值顯著增加到1 924 Ω（曲線b），表明cDNA已成功固定在Au電極上，阻礙了氧化還原探針與電極之間的電子傳遞。使用MCH封閉Au非特異性位點后，Ret增加到2 407 Ω（曲線c）。Fc-Apt加入后，Ret進一步增加到2 656 Ω（曲線d），表明Fc-Apt已在電極表面組裝。加入目標物AFB1后，電極的Ret降低到2 264 Ω（曲線e），表明目標物與適配體之間的特異性識別導致Fc-Apt從傳感器表面解離。以上EIS結果表明，該電化學適配體傳感器已經構 建成功。

圖2 不同修飾電極的EIS響應曲線

為了驗證所構建傳感器用于AFB1檢測的可行性，測量了傳感器對不同濃度AFB1的ACV響應。如 圖3所 示，Fc-Apt/MCH/cDNA/AuE電 極在+0.42 V處有明顯Fc氧化峰（曲線a），其峰值電流為2.92 μA。當AFB1存在時，其與適配體的特異性識別導致Fc-Apt從電極表面解離，IFc降低；AFB1濃度為0.1 ng/mL時，IFc值為2.6 μA（曲線b）；而當AFB1濃度為1.0 ng/mL時，IFc值降低為2.37 μA（曲線c）。以上結果證實了該適配體傳感器用于檢測AFB1的良好可行性。

圖3 傳感器檢測AFB1的可行性

2.2 實驗條件優化

為了獲得最優的信號響應，對傳感器制備和AFB1檢測過程中的實驗條件進行了優化。電極上的Fc組裝量會嚴重影響電化學傳感器的檢測靈敏度，而Fc的組裝量依賴于Fc標記的cDNA的濃度。如圖4（a）所示，隨著AFB1的加入cDNA的濃度不斷增大，ΔIFc先快速增大，在cDNA濃度為2.4 μmol/L時達到峰值，然后有所下降。這是由于cDNA濃度的增加會引起空間位阻和靜電排斥，導致cDNA在電極表面形成發夾結構的能力下降。因此，適宜選用2.4 μmol/L的cDNA構建適配體傳感器。

AFB1與適配體反應的孵育時間是適配體傳感器的另一個重要參數。如圖4（b）所示，隨著孵育時間的增加ΔIFc的值開始快速增加，但40 min后無明顯變化。說明40 min足以進行AFB1檢測時的特異性識別。因此，選擇40 min作為檢測AFB1的最佳孵育時間。

圖4 構建傳感器的實驗條件優化

2.3 傳感器的分析性能

在最優實驗條件下，對該適配體傳感器檢測AFB1的分析性能進行了評估。如圖5所示，隨著AFB1濃度增大，IFc逐漸降低，表明可以用IFc的值來表征AFB1的濃度。圖6給出了IFc與AFB1濃度對數的線性回歸曲線。可知，傳感器對AFB1的線性響應范圍為1.0 pg/mL～1.0 μg/mL，檢出限為0.33 pg/mL，線性回歸方程 為IFc=0.228-0.145 LogCAFB1，相 關 系 數（R2）為0.995。

圖5 傳感器對不同濃度AFB1的ACV響應曲線

圖6 傳感器檢測AFB1的線性回歸曲線

表2列出本文構建的傳感方法與已報道的AFB1檢測方法的對比。結果表明，與HPLC-MS[4]、比色法[19]、熒光[6]、電化學發光[20]等檢測方法相比，本文構建的適配體傳感器具有更低的檢出限。與電化學DPV（基于絲網印刷電極）[22]、電化學阻抗EIS（基于MWCNTs/RTIL修飾玻碳電極）[23]等方法相比，本文構建的適配體傳感器具有相當或更低的檢出限，表明該傳感器具有優越的分析性能。

表2 本研究構建的傳感方法與已報道的AFB1檢測方法分析性能對比

2.4 傳感器的選擇性、重現性和穩定性

為了評估該傳感器的選擇性，使用一些常見真菌毒素進行了干擾實驗，干擾物包括OTA、FB1、ZEN和AFB2。其中，AFB1濃度為10 ng/mL，干擾物濃度均為100 ng/mL。如圖7所示，對干擾物的響應幾乎與背景信號相同，只有AFB1能引起明顯的電流響應。結果表明，該適配體傳感器對AFB1具有良好的選擇性。

圖7 傳感器對AFB1與AFB2、ZEN、OTA、FB1的響應對比

此外，使用6根不同傳感電極檢測相同濃度的AFB1（1ng/mL），以評估傳感器的重現性。由圖8可知，6組測試結果的相對標準差（RSD）為2.0%，表明傳感器具有較高的重現性。此外，我們還研究了該適配體傳感器的穩定性，見圖9。在4℃冰箱中儲存后，傳感器對AFB1響應的相對標準偏差為5.3%，表明傳感器具有較滿意的穩定性（7 d）。

圖8 傳感器6次平行測量1 ng/mL AFB1的重現性

圖9 傳感器的7 d穩定性

2.5 實際樣品分析

將該傳感方法應用于玉米樣品中AFB1的檢測，以驗證該方法的實用性。表3列出了該傳感方法對玉米樣品中AFB1進行檢測的結果?？芍搨鞲蟹椒▽FB1檢測的回收率為93.0%～102.5%。相對較低的RSD表明，該方法用于實際樣品檢測具有較高的實用性。

表3 玉米樣品中AFB1的檢測結果

3 結論

本文設計了一種基于二茂鐵標記適配體的電化學適配體傳感器，用于靈敏檢測玉米中的AFB1。適配體的引入提高了電化學傳感的選擇性，電化學探針Fc的引入提高了傳感器的靈敏度。該傳感策略結合了電化學檢測與基于DNA構象變化的開關探針的優點，因而構建的傳感器具有較高的靈敏度和選擇性。其對AFB1的線性檢測范圍為1.0 pg/mL～1.0 μg/mL，檢出限低至0.33 pg/mL。此外，還將該傳感器應用于加標玉米樣品中AFB1的檢測，結果回收率為93.0%～102.5%，RSD低于4.6%，表明具有較好的實用性。通過改變目標物的適配體，該策略可以很容易地拓展到對各種生物分子的檢測，具有很好的應用潛力。