Gremlin1在膽囊癌中的表達及臨床意義

朱文娟，石麒麟，夏慧，張曉嵐，朱亞平，胡丕偉

膽囊癌是膽道系統最常見的惡性腫瘤，其是消化系統中第六大常見的惡性腫瘤[1]。膽囊癌存在種族和地理差異，在西方國家發病比較少見，但在南美、東歐、東南亞中部國家或地區相對多見[2]，特別是在中國、印度及日本等國家多發。由于其起病隱匿，惡性程度高，起病常處于晚期，因此預后較差。Gremlin1蛋白是一種促血管生長因子，是骨形態發生蛋白（BMP）的拮抗劑，是一種具有重要生物學意義的調節劑，因其在組織細胞分化和胚胎發育中發揮關鍵作用，近年來被發現在腫瘤發生、發展、炎癥反應和侵襲轉移等方面發揮重要作用。本研究分析Gremlin1在膽囊癌不同臨床病理學參數中的差異，探討其在膽囊癌組織中的臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月至2021年11月在浙江省湖州市第一人民醫院進行膽囊手術后確診為膽囊癌的75例患者，所有患者手術前均未接受放療、化療及靶向治療等抗腫瘤治療，且無其他消化道腫瘤病史。另選取20例正常膽囊標本納入正常組，其中男6例，女14例。所有標本均經甲醛固定，制備4 m連續切片。本研究經醫院倫理委員會審查通過。

1.2 方法 免疫組織化學研究采用En-Vision二步法，組織經連續切片，烤片、脫蠟、水化，3%H2O2封閉，高壓鍋抗原修復，加入一抗（Gremlin1、Ki-67均購自Abcam公司）過夜，DAB顯色、蘇木素復染。用PBS代替一抗作為空白對照，Gremlin1以結腸癌組織作為陽性對照，Ki-67以正常扁桃體組織作為陽性對照。

1.3 結果 判定由本院兩名資深病理科專科醫生獨立進行評估，每張切片隨機選取5個視野（×200），閱片前不知道臨床數據和病理結果。計數并判斷染色程度，半定量積分法判定結果。染色程度評分：（1）不染色為0分；（2）輕度染色，淺黃色1分；（3）黃色2分；（4）顏色較深，棕黃或棕褐色3分。染色細胞占計數細胞的百分率判定：（1）＜5%記0分，（2）5%～25%記1分，（3）26%～50%記2分，（4）＞50%記3分。以陽性細胞染色比例與程度評分相乘結果：0～1分 為陰性，2～3分為弱陽性，4～6分為中度陽性，7～9分為強陽性。將染色陰性和弱染色定義為陰性組，將中等和強染色定義為陽性組[3]。Ki-67在膽囊癌細胞的細胞核中表達，計算陽性染色的腫瘤細胞核占總的腫瘤細胞占的百分比，≥20%認為是陽性，＜20%為陰性[4]。

1.4 隨訪 于2022年1月通過電話隨訪患者治療、有無化療、生存及復發等情況。

1.5 統計方法 采用SPSS 23.0統計軟件進行分析，計數資料采用2檢驗，采用Kaplan-Meier法對隨訪資料進行生存分析，采用Log-rank檢驗各組生存率之間的差異。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床及病理資料 75例膽囊癌患者中，男21例，女54例；中位年齡69歲。術前臨床診斷膽囊炎和/或膽囊結石38例，診斷為膽囊占位或膽囊腫物36例，診斷為梗阻性黃疸1例。術后病理證實腺癌為主73例，1例黏液腺癌，1例腺鱗癌；病灶周圍合并上皮內瘤變23例，未合并上皮內瘤變52例；0～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期22例。

2.2 膽囊癌及正常組織中Gremlin1的表達 免疫組化結果顯示Gremlin1在部分膽囊癌及正常膽囊組織中均有表達（封三彩圖5）。Gremlin1在膽囊癌中的陽性率為50.67%（38/75），在膽囊正常組織中的陽性率為15.00%（3/20）。

圖5 Gremlin1在部分膽囊癌及正常膽囊組織中的表達

2.3 膽囊癌中Gremlin1表達與臨床病理特征的關系 膽囊癌及正常膽囊組織Gremlin1表達差異有統計學意義（P＜0.05）。不同年齡、性別之間Gremlin1表達差異均無統計學意義（均P＞0.05），而在淋巴結是否轉移、腫瘤分期、有無合并上皮內瘤變中Gremlin1表達差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 膽囊癌中Gremlin1表達與臨床病理特征的關系 例（%）

2.4 Kaplan-Meier生存分析 結果顯示Gremlin1表達陽性的膽囊癌患者的存活時間明顯短于Gremlin1表達陰性的患者，見圖1。

圖1 陰性組與陽性組Kaplan-Meier生存分析

3 討論

Gremlin1由骨髓間充質干細胞分泌，可以與BMP-2、4、7直接通過胱氨酸結合[5-7]，從而阻斷BMP與其相應受體結合形成拮抗作用的一種分泌型蛋白。早期研究中，人們主要認識到Gremlin1通過BMP/Smad信號通路在胚胎發育、器官及骨骼生長發育過程中發揮重要作用。近年來，隨著BMP/Smad信號通路在腫瘤領域的作用被認知，特別是在腫瘤診治和骨轉移中的新認知，作為BMP/Smad通路拮抗劑的Gremlin1越來越被更多人認識，并開展深入研究[8]。此外，Stabile等[9]發現作為BMP拮抗劑Dan家族成員，Gremlin1被確定為一種新型血管內皮生長因子激動劑，可以與靶內皮細胞直接相互作用，促進內皮細胞增殖和血管形成，這種新穎而重要的能力被認為是一種新的、以前未被認識的能力，Gremlin1蛋白在人類腫瘤血管生成發育中起重要作用[10]。總之，Gremlin1被認為是癌癥中的一種新型致癌或促血管生成因子。BMP通路是在腫瘤進程中具有雙重作用[11]，因為它具有促進腫瘤和抑制腫瘤的雙重活性，具體取決于癌細胞類型、腫瘤微環境和腫瘤生長階段。因此，Gremlin1的表達水平與腫瘤預后的關系可能會因為不同組織、不同病理類型、不同腫瘤微環境及腫瘤生長階段不同而出現截然不同的結果。大多數研究顯示Gremlin1水平在多個腫瘤及其基質中過度表達，并且Gremlin1過表達與腫瘤分期、預后密切相關，包括結腸癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌及膽管細胞癌等[12-14]。與對照受試者相比，大多數人類惡性間皮瘤組織中的mRNA和蛋白質水平均顯示出升高[15]。

Gremlin1的表達與多種腫瘤的進展和預后有關，因此，有研究者提出Gremlin1可能是癌癥中一個有前途的預后生物標志物和治療靶點。但Gremlin1在膽囊癌中的表達始終未見報道。而眾所周知，膽囊癌是一種罕見的侵襲性惡性腫瘤，從診斷初起中位生存期較短，總體預后較差。有效的治療包括早期發現和手術治療。盡管治療仍主要是手術治療，但局部治療和基于分子醫學的定向治療等較新的方式已讓晚期疾病患者的預后得到改善。提高對膽囊癌變的病理分子機制的了解對于完善診斷、預后以及為晚期膽囊癌惡性腫瘤患者開發新的靶向治療非常重要[16]。本研究使用免疫組織化學研究了正常膽囊及膽囊癌Gremlin1蛋白的表達，Gremlin1在膽囊癌中的分布模式與正常膽囊上皮細胞相似；膽囊癌組織中Gremlin1蛋白表達明顯增多，Gremlin1陽性表達與淋巴結轉移、腫瘤分期，合并上皮內瘤變有關（均P＜0.05），總之與膽囊癌預后相關。同時本研究也發現Gremlin1表達陽性的膽囊癌患者的存活時間明顯短于陰性患者，這證實Gremlin1可能是膽囊癌預后的一個參考指標。Wu等[14]在肝外膽管細胞癌中也有類似發現，Gremlin1表達陽性的肝外膽管癌存活時間明顯短于陰性者，陽性表達是患者獨立不良預后因素。

綜上所述，Gremlin1是與癌癥發展相關的多個過程的關鍵參與者，包括增殖、遷移、侵襲和上皮-間質轉化。Gremlin1在膽囊癌細胞中的表達升高表明Gremlin1可能在膽囊癌的發生、發展中發揮重要作用，具體參與機制仍有待進一步研究。