實時熒光聚合酶鏈反應檢測新型冠狀病毒室內質控方法初探

劉 晶，杜晶輝，劉瑞巖，鮑志軍，賀 鑫，趙 巖，王 俊，雷曜榮，劉 旭

天津中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科/國家中醫針灸臨床醫學研究中心,天津 300193

新型冠狀病毒核酸檢測是我國常態化疫情防控的技術保障，已在全國二、三級醫療機構廣泛開展，是切斷病毒傳播的重要防線。實時熒光聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術具有高靈敏度、高效高通量的優勢，可在疾病早期或潛伏期內識別微量的病毒核酸片段[1]，是《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》推薦的常規檢測方法[2]。為確保核酸檢測結果的準確性，各實驗室需具備完善的實驗室質量控制體系。2021年5月國家衛生健康委員會頒布的《新型冠狀病毒肺炎防控方案》(第八版)文件指出[3]，實驗室應規范開展室內質控，每批檢測至少有1 份弱陽性質控品、3 份陰性質控品，室內質控是全面質量控制體系的關鍵環節。新型冠狀病毒RT-PCR檢測方法屬于定性分析，僅簡單判斷陰陽性質控是否在控，無法評價核酸提取效率是否達標、檢測過程是否存在系統誤差或偶然誤差。本文在陰陽性質控在控的基礎上，將定性PCR結果進行計量資料轉換，統計弱陽性質控靶基因循環閾值(Ct值)，繪制Levey-Jennings質控圖，回顧性分析檢測系統的穩定性。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 全自動核酸提取儀BG-Flex-96，配套核酸提取及純化試劑TQ-BG-003-96D-96，新冠病毒核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)，以上均購自上海伯杰公司。實時定量PCR儀QuantStudio 5，購自美國Thermofisher公司。

1.2質控物來源 本實驗質控物來自第三方噬菌體假病毒顆粒，批號2021005，濃度范圍：5.35×103+3～5.24×104+4 copy/mL，購自廣州邦德盛生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1新冠病毒核酸檢測 新冠病毒的核酸檢測嚴格按照伯杰試劑說明書和按本實驗室標準操作規程文件進行操作。使用伯杰核酸提取試劑96孔板吸取200 μL樣本，首先樣本與裂解液和磁珠結合，經過兩次洗滌去除蛋白質和雜質，洗脫出核酸。將5 μL核酸加入20 μL擴增反應液，形成25 μL反應體系，在PCR儀進行擴增反應，應用QuantStudioDesign & Analysis軟件進行擴增曲線分析進行結果判讀。每批次檢測均設置3個陰性質控、1個弱陽性質控。

1.3.2弱陽性質控稀釋倍數的選擇 使用無菌生理鹽水按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40對第三方質控物進行倍比稀釋，每個稀釋倍數分裝8支，每支200 μL，分裝至1.5 mL離心管。配制完成后，5個濃度水平的40支質控物立即進行RT-PCR核酸檢測。

1.3.3繪制定性檢測散點圖 記錄每批次陰性質控和弱陽性質控的結果并按照自定義數值繪制定性結果散點圖：將弱陽性質控定義為數值“1”，檢測為陽性時定義數值為“2”，檢測為陰性時定義數值為“-2”；將陰性質控定義為“-1”，檢測為陰性時定義數值為“-2”，檢測為陽性時定義數值為“2”；將質控品定義數值與檢測結果定義值相加，等于“3”或“-3”為在控，等于“1”為假陽性反應，等于“-1”為假陰性反應[4]。

1.3.4弱陽性質控的配制與數據采集 (1)弱陽性質控的配制：首先使用生理鹽水將第三方質控物按1∶3稀釋分裝至1.5 mL離心管(無RNase)，置于-80 ℃冰箱貯存備用。每批檢測時取一支配制好的質控物，室溫平衡，充分混勻并瞬離。進行核酸提取時，弱陽性質控位置加入20 μL配制陽性質控+180 μL生理鹽水，共200 μL，即再進行10倍稀釋。(2)收集本實驗室2022年1-2月每批次實驗的原始數據；統計所有實驗批次弱陽性質控的靶基因Ct值，建立Excel 2010數據庫錄入數據。分別對N基因和ORF1ab基因兩組Ct值進行正態分布檢驗，當P>0.05表示服從正態分布，當P<0.05表示不服從正態分布。

1.3.5繪制Levey-Jennings質控圖 根據前20次檢測結果分別計算N基因和ORF1ab基因的靶值X和標準差s，上下限為X±3s，警告限為X±2s。以檢測次數為橫坐標，以Ct值為縱坐標繪制Levey-Jennings質控圖。

1.4統計學處理 使用Microsoft Excel 2010進行數據的統計、分析、制圖。應用IBM SPSS21.0對數據進行正態分布檢驗。

2 結 果

表1 5個稀釋倍數的弱陽性質控靶基因Ct值比較(n=8)

2.2RT-PCR定性室內質控散點圖 根據自定義數值繪制定性檢測結果散點圖，如圖1所示。在97個批次檢測結果中出現1次失控，即第85次(即2月2日第3批次)弱陽性質控檢出陰性結果出現了“假陰性”反應。發現失控后，立即采取糾正措施并復檢。

圖1 熒光PCR定性室內質控散點圖

2.3弱陽性質控靶基因Ct值的正態性檢驗 2021年1-2月份弱陽性質控靶標N基因、ORF1ab基因Ct值進行正態性檢驗，結果兩組數據均符合正態分布(P>0.05)。見圖2。

注：N基因Ct值正態分布(P=0.574)ORF1ab基因Ct值正態分布(P=0.08)。

2.42022年1-2月弱陽性質控靶基因Ct值Levey-Jennings質控圖 弱陽性質控N 基因靶值X為34.13，標準差s為0.652，變異系數CV為1.91%。結果如圖3所示，所有Ct值均在X±3s以內，5次出現±2s警告，根據Westgard多規則法分析，符合質控規則。弱陽性質控ORF1ab基因靶值X為35.30，標準差s為0.910，CV為2.58%。第73次檢測(2月20日)Ct值超過+3s，見圖4。經原始曲線分析，該次檢測ORF1ab曲線第1～10個循環基線波動較大，整體信號強度較低。5次出現±2s警告，根據Westgard多規則法分析，第31～41批次檢測違反了10x規則，第73～80批次違反了R 4s規則。

圖3 2022年1-2月弱陽性質控N基因Levey-Jennings質控圖

圖4 2022年1-2月弱陽性質控ORF1ab 基因Levey-Jennings質控圖

3 討 論

目前RT-PCR法是臨床上廣泛應用的新冠病毒核酸檢測方法，是確診COVID-19的直接證據[3]，因此準確的核酸檢測結果在疾病診斷和疫情防控中承擔重要作用。《新型冠狀病毒實驗室檢測專家共識》指出[5]，實驗室應從試劑質量控制、操作質量控制、設置對照、多指標診斷等多方面避免假陰性、假陽性結果出現。因此做好全過程質量控制，特別是室內質量控制尤為重要，它是連續評價實驗室工作可靠性程度的方法，是確定檢測結果是否可靠、可否發出報告的關鍵環節[6]。

首先，本研究選用第三方假病毒技術的陽性質控品，原因是假病毒技術以MS2噬菌體外殼蛋白為載體，包裹核酸檢測的靶標RNA，具有真實病毒相似的物理結構，可參與核酸提取、反轉錄、擴增全過程，實現核酸檢測的全過程質量控制[7-8]。第三方邦德盛的陽性質控品(濃度范圍：5.35×103+3～ 5.24×104+4 copy/mL)，為確定弱陽性質控的稀釋倍數，進行5個稀釋倍數的平行試驗，結果表明，確定最接近檢出限且穩定性高的稀釋倍數為1∶30，平均濃度為556.7 copy/mL(濃度范圍：178.3～1 746.7 copy/mL)，是核酸檢測試劑檢出限(500 copy/mL)的1.2倍左右，符合弱陽性質控品的濃度要求。

其次，關于核酸檢測熒光PCR法的室內質控，文件規定“每批檢測至少有1份弱陽性質控品(第三方質控品)、3份陰性質控品(生理鹽水)[3]。”“核酸檢測試驗以及其他定性試驗可選擇適當濃度的質控物，采用定性檢測結果合格即判為在控的方法[9]。”據此本研究采用自定義弱陽性質控及陰性質控數值的方法，繪制核酸檢測定性室內質控散點圖，直觀地反映出質控品的檢測結果與預期檢測結果不一致的情況并判定為“失控”，繪制定性質控散點圖簡單易行，符合國家相關規定。

最后，Ct值是擴增曲線與閾值線的交叉點，是判讀結果是否為陰(陽)性的重要依據，是熒光PCR反應中靶標濃度的相對測量[10]。為更加精細的進行PCR實驗室質控管理，本研究參照定量測定室內質控的方法，基于靶基因Ct值建立室內質控的L-J質控圖，可分辨檢測過程的系統誤差和偶然誤差，提高檢測的準確性和精密度。本研究共累積2022年1-2月每批次檢測的弱陽性質控Ct值97個，對兩組靶基因Ct值數據進行正態性檢驗后，均符合正態分布，適宜采用L-J質控圖分析其離散程度和變化趨勢。本研究對上述弱陽性質控Ct值進行了L-J圖分析，如圖3、4所示。結果表明，N基因的CV為1.91%，ORF1ab基因的CV為2.58%，盡管目前沒有明確的病毒核酸可接受的CV范圍，但可以肯定的是長期統計室內質控CV值是反映實驗室每個檢測環節的穩定性，能夠檢測操作中的長期變化趨勢，及時發現測定過程中存在的問題[11-12]。

如圖4所示，結果表明ORF1ab基因第73批次超過3s屬于偶然誤差，產生偶然誤差的原因可能是(1)核酸提取過程中靶基因丟失、或存在PCR抑制物的殘留[13];(2)試劑問題，如反轉錄酶的失活;(3)人員操作失誤。根據Westgard多規則質控法，第31～41批次違反了10x規則屬于系統誤差，第73～80批次違反了R 4s規則，離散程度較大，同樣屬于系統誤差，通過分析，產生系統誤差的原因是PCR反應前10個循環基線波動較大，擴增曲線不平滑，S型曲線在對數增長期斜率偏低。查找原因發現八連排離心管由于質量問題與擴增儀小孔不服帖，導致受熱不均勻，影響擴增結果。因此通過弱陽性質控靶基因Ct值的L-J質控圖，可分析出偶然誤差和系統誤差出現的原因，及時采取糾正措施，從而提高核酸檢測結果的可靠性。

本研究中，定性室內質控散點圖是判斷該批次檢測是否有效、是否可發出報告的依據，L-J質控圖用作回顧性分析熒光PCR檢測系統穩定性的方法，分析偶然誤差或系統誤差的原因，及時發現操作過程失誤或試劑耗材質量問題。當定性室內質控散點圖和L-J質控圖兩種方法結果不一致時，本實驗室以定性質控散點圖“失控”作為質控失敗重新復檢的依據。

綜上所述，本文創新性的提出將定性質控散點圖及L-J質控圖聯合應用于熒光PCR檢測新冠病毒的室內質控，能夠較全面地反映核酸檢測的有效性和穩定性，監控核酸提取、擴增全過程。這2種方法在本實驗室已應用近1年時間，效果優于既往的“陰陽性質控在控即合格”單一判斷方法，具有很好的預警功能。