血清HE4在慢性腎臟病中的表達水平及機制研究進展*

高冉冉，胡洪貞，韓 聰，宋慧慧，申 振，艾珊珊 綜述,李 偉△ 審校

1.山東中醫藥大學，山東濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東濟南 250014

慢性腎臟病(CKD)作為一種慢性疾病，在世界范圍內發病率逐年上升，全球負擔巨大，全球約10% 的成年人受到某種形式的慢性腎臟疾病的影響，每年導致120萬人死亡[1]。腎臟纖維化是慢性腎臟病的主要特征之一，若不及時進行有效干預治療，將逐漸導致終末期腎臟病(ESRD)。而一旦發展為ESRD，常需進行腎臟替代治療，將給患者帶來巨大的經濟負擔和精神壓力。目前，CKD通常依賴于估算腎小球濾過率(eGFR)來進行分級，eGFR會受血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)等因素影響，然而STEUBL等[2]研究表明，在40%～50%的腎實質受到可逆或不可逆損傷時血清中肌酐的濃度才會升高，因此血肌酐在CKD早期診斷中缺乏特異性。某些生物學標志物可以預測CKD的進展，尋找高靈敏度和特異度的生物學標志物進行早期篩查干預，能有效延緩CKD進展為終末期腎臟病的進程和降低死亡率，提高患者預后和生存質量。近年來人附睪蛋白4(HE4)作為腫瘤標志物被廣泛應用于卵巢癌等癌癥的早期篩查中。后有研究發現在非腫瘤慢性腎臟病患者中血清HE4水平普遍升高，有學者認為其升高主要與eGFR下降和HE4作為蛋白酶抑制劑參與腎纖維化的進程相關，但分析尚不全面，未充分闡明其機制。本文就血清HE4和慢性腎臟病、腎臟纖維化之間的潛在聯系作一綜述，以探討HE4在慢性腎臟病和腎臟纖維化中的表達影響機制，進一步探究其臨床意義，以期提高其臨床應用價值。

1 HE4

1.1HE4的生物學特性及功能 HE4最早在1991年由Kirchhoff從人附睪上皮中克隆出來，也被稱為WAP四二硫化物核心域蛋白2(WFDC2)。HE4基因多表達在呼吸系統和生殖系統管道上皮細胞，后研究發現HE4在腎臟遠曲小管中也有表達[4]。其蛋白結構屬于含4個二硫鍵核心區域的乳酸性蛋白家族，包含八個半胱氨酸組成的WAP結構[3]，是一種相對分子質量較小的、酸性的、半胱氨酸含量豐富的分泌性糖基化蛋白[4]。現研究發現HE4的已知編碼基因位于染色體20q12-13.1上，長度約12 kb，包含4個內含子和5個外顯子，相對分子質量約為25×103[5]，已被證實是一種新型蛋白酶抑制劑，能抑制各種絲氨酸蛋白酶、胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和基質金屬酶蛋白的活性[6]。WFDC2基因啟動子含有不同的與炎癥相關的轉錄因子結合位點，包括NF-KB因子，表明HE4可能在炎癥中發揮潛在作用[4]，此外HE4還具有促進細胞增殖和腫瘤生長、入侵遷移和黏附的作用[7]。

1.2人附睪蛋白的影響因素 目前研究表明HE4基因多在卵巢癌患者體內表達明顯[7]，與癌癥的進展和轉移相關，在臨床上多作為診斷卵巢癌的生物學標志物[8]。有學者在研究血清HE4時提出除腫瘤因素影響外，血清HE4水平還受多種人口統計學變量的影響，如年齡、性別、吸煙史、更年期、懷孕或體重指數升高等[9-10]。FERRARO等[9]的一項系統評價結果顯示，HE4血液濃度男性比女性大約低7%～9%，吸煙者比不吸煙者高20%～30%，與體質量指數成負相關；絕經狀態和年齡都是影響HE4水平的重要因素，年齡主要影響絕經后女性HE4水平。絕經后人群的HE4水平高于絕經前人群，并隨著年齡的增長而升高。近年來不少報道中指出血清HE4濃度會隨著血肌酐水平升高而升高，兩者呈正相關[11-12]。在BOLSTAD等[13]的一篇報道中指出以Scr為50 μmol/L作為基線，Scr為70 μmol/L時，HE4水平升高12%，80 μmol/L時升高17%，90 μmol/L時升高22%，100 μmol/L時升高27%。

2 HE4與CKD

2.1血清HE4作為腎功能進展標志物 通過Scr或胱抑素C(Cys C)估算eGFR是目前常用的評估腎功能的指標，但受人種、體型、飲食、藥物等非濾過性病理及生理因素的影響，估算eGFR結果會存在偏差[14]。有研究表明,Scre和Cys C在CKD早期階段表達水平缺乏特異性，當腎臟出現實質性損傷時濃度才會升高[15]，因此進一步尋找能早期反映腎功能的多樣化生物學指標意義重大。

近年來，多項研究發現血清HE4濃度與腎功能程度之間有著密切的關聯，宋勇林等[16]研究顯示在CKD患者中血清HE4水平呈現升高且隨著CKD分期的增高而升高，在該研究中ROC曲線分析結果顯示，HE4對CKD的診斷價值優于β2-微球蛋白(β2-MG)、BUN等傳統腎功能指標。WANG等[3]通過Person相關分析比較HE4濃度和常規腎功能指標相關性得出HE4與Scr、BUN和Cys C呈正相關，與GFR呈負相關，且HE4對CKD的診斷價值高于Scr、BUN和Cys C。由此可見，HE4可作為腎功能不全潛在診斷和預后判斷的新型生物標志物[17]。

2.2血清HE4水平受腎功能進展影響機制 HE4相對分子質量約為25×103，相對分子質量相對較小可以通過腎臟濾過膜，當腎功能損傷時，腎臟的濾過和重吸收功能受影響，HE4的過濾受到干擾從而在血清中濃度升高[18]，在表達上呈現相對特異度。

腎周毛細血管稀疏，組織氧供減少是慢性腎臟病進展的一個重要因素[19]。慢性缺氧可通過誘導缺氧誘導因子1 (HIF-1)的激活，進而促進腎小管上皮細胞轉分化、增加細胞因子、誘導腎小球內皮細胞凋亡等機制導致慢性腎臟病進展。張磊[20]構建HE4啟動子的報告基因載體及其截短體，通過熒光素酶報告基因實驗和CHIP實驗表明HIF-1α通過直接結合在HE4啟動子上轉錄調控HE4的高表達，缺氧可以顯著增加腎小管上皮細胞中的HE4，上調HE4水平。

3 HE4與腎臟纖維化

3.1血清HE4作為腎臟纖維化程度標志物 CKD的終末病理結局以廣泛腎臟纖維化為主要特征[21]。廣泛腎臟纖維化作為慢性腎臟病終末病理結局的主要特征，其表現是腎臟固有細胞的纖維化，實質是腎固有細胞的受損壞死。早期發現和干預可以顯著延緩病情進展，減少并發癥，提高生存率。腎臟纖維化的診斷依賴于腎臟生理病理表現[22]，組織病理學檢查目前被認為是診斷腎纖維化的金標準，然而腎活檢存在一定的局限性，有發生并發癥的可能[21]。確定靈敏和準確的腎纖維化無創生物學標志物對腎病患者的早期診斷和治療至關重要。多項研究表明，在腎損傷的患者中血清HE4水平和腎纖維化水平呈正相關[23-26]。LUO等[27]在研究中用ROC分析血清HE4的診斷能力，以141 pmol/L為臨界值，HE4的曲線下面積(AUC)值為0.857(95%CI，0.779～0.934)，用于區分有腎臟纖維化和無腎臟纖維化的患者，其靈敏度和特異度分別為82.1%和84.0%，免疫組化結果顯示，腎活檢標本中HE4表達的增加與腎臟纖維化密切相關，而血清HE4濃度與腎活檢中HE4組織表達濃度顯著相關，故血清HE濃度可反映腎臟纖維化。LINOQUIST等[28]通過比較纖維化相關成纖維細胞和正常成纖維細胞發現HE4在基因和蛋白水平上的表達水平顯著增加，而且對1例遺傳性腎炎患者的腎活檢進行觀察，他們發現HE4在人類纖維化腎臟中的表達升高。基于多項研究結果表明HE4可作為預測腎臟纖維化程度的潛在生物標志物。

3.2血清HE4水平受腎臟纖維化影響的機制 腎臟纖維化是多方因素共同作用的結果，是一個復雜的病理過程，其發生和進展由腎小球硬化、腎小管間質纖維化、炎細胞浸潤以及腎實質丟失等共同參與[29]。此外，還有研究指出核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路、轉生長因子β(TGF-β)/Smads信號通路是腎臟纖維化主要的通路[30]。關于腎臟纖維化的主要環節，ZHANG等[31]認為包括炎細胞浸潤、細胞因子表達異常、上皮間充質轉化、細胞外基質(ECM)異常堆積等是破壞腎臟正常組織結構并最終導致腎功能進行性喪失的主要原因。以下將主要圍繞這幾點展開論述血清HE4水平受腎臟纖維化影響的機制。

3.2.1HE4與肌成纖維細胞 活化的成纖維細胞，即肌成纖維細胞，其能表達平滑肌肌動蛋白，被認為是腎臟纖維化的關鍵介質[28]。LEBLEU等[34]使用α SMA-RFP轉基因小鼠模型追蹤和分離肌成纖維細胞，進行基因表達譜分析，發現肌成纖維細胞中HE4基因上調最高。

3.2.2HE4與炎細胞浸潤 在纖維化啟動初始階段腎小管細胞損傷導致局部炎癥形成，激活先天免疫系統，進而合成和釋放促炎癥和纖維化的細胞因子[28]。在炎細胞浸潤促纖維化過程中，炎癥細胞可產生纖維生長因子促進局部成纖維細胞或炎癥細胞本身增殖產生ECM促纖維化；炎癥細胞也可直接轉化為膠原生成纖維母細胞或肌纖維母細胞促纖維化[32]。而炎癥和感染可能是HE4分泌的補充因素，BENE等[33]研究發現炎性因子白細胞介素-6(IL-6)、IL-8的表達與HE4 mRNA具有相似的時間依賴變化模式，HE4受NF-κB通路和促炎信號傳導上調。故在腎臟纖維化中血清HE4水平會上調。

3.2.3HE4與ECM異常堆積 纖維化過程中的典型標志是細胞外基質的過度沉積。關于細胞外基質異常堆積促纖維化，NOGUEIRA等[29]提到蛋白纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)、凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)、結締組織生長因子(CTGF)、膠原Ⅰ、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)及基質金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP1)等促細胞外基質分子會使細胞外基質沉積增加，從而促進腎臟纖維化。一項研究在單側輸尿管梗阻(UUO)小鼠模型中分析與ECM沉積相關基因時發現HE4表達顯著上調[31]。研究認為基質金屬蛋白酶及其組織抑制劑是ECM沉積的主要因素，而HE4作為一種蛋白酶抑制劑，可以抑制絲氨酸蛋白酶和基質金屬蛋白酶等多種蛋白酶的活性，特異性地抑制I型膠原的降解，導致細胞外基質降解減少，介導腎臟纖維化[3,34]。此外，過表達的HE4還能激活NF-κB通路抑制MMP-2的表達，從而減少細胞外基質降解促進腎臟纖維化[20]，因此慢性腎病患者腎臟纖維化過程中血清HE4顯著升高[23]。

3.2.4HE4與上皮間充質轉化 關于上皮間充質轉化(EMT)的最新研究表明上皮細胞附著于基底膜轉化為肌成纖維細胞，上皮細胞經歷細胞周期停滯和代謝改變，誘導免疫細胞浸潤和擾亂上皮間充質串擾，啟動和加速纖維化過程[35]。基于EMT中上皮細胞附著于基底膜轉化為肌成纖維細胞這一研究結論，筆者推測可能在EMT過程中基底膜侵襲和黏附力增強，而HE4參與基底膜侵襲和黏附[7]，故血清中HE4表達可能上調。

4 討 論

慢性腎臟病是指腎臟結構或功能異常>3個月[36]。涵蓋病種廣泛，主要包括各種原發的、繼發的腎小球腎炎、腎小管損傷和腎血管的病變等，原發性病變主要包括膜性腎病、IgA腎病等，繼發性病變主要包括糖尿病腎病、高血壓腎病、過敏性紫癜腎炎、紅斑狼瘡腎炎等[37]。腎小球血管血流動力學的改變出現高灌注和高濾過狀態、腎單位高代謝、腎組織上皮細胞表型轉化、腎素-血管緊張素-醛固酮系統的激活等均會促進腎臟纖維化，腎臟纖維化是慢性腎臟病進展為腎功能不全的共同通路[38]。隨著病情的不斷進展，各種心腦血管事件(如心肌梗死、中風、心力衰竭等)風險增加、患者總體死亡率的風險也顯著增加[1]。據估計，到2040年CKD將成為全球第五大死亡原因，是所有主要死亡原因中預計增長最大的原因之一[39]。因此能及時發現、早期干預是延緩慢性腎臟病進展、減少并發癥和提高生存率的關鍵[37]。

HE4是一種相對分子質量較小的、酸性的、半胱氨酸含量豐富的分泌性糖基化蛋白，具有蛋白酶抑制、炎癥反應和促進細胞增殖、黏附的作用。血清HE4濃度在早期慢性腎臟病患者中升高[16,40]，與腎臟纖維化程度和血肌酐水平呈正相關，與eGFR之間負相關,對CKD的早期診斷價值更優于Scr、BUN和Cys C[3,16]，可作為反映CKD嚴重程度和腎臟纖維化程度的標志物。本文通過詳細綜述，分析其機制：在慢性腎臟病中，腎功能受損腎小球濾過功能下降導致血清HE4濾過受干擾，以及慢性腎臟病進展過程中組織缺氧增加腎小管上皮細胞中的HE4，故血清HE4水平升高；在腎臟纖維化過程中，HE4可通過抑制絲氨酸和基質金屬蛋白酶等的活性促ECM沉積、隨肌成纖維細胞表達上調、經NF-κB等信號通路促炎細胞浸潤、參與EMT等介導腎臟纖維化。故血清HE4水平隨腎纖維化程度進展而升高并可對慢性腎臟病預后評估有一定的指導意義。在目前腎活檢因其有創性不被大多數患者所接受及其他生物學標志物在疾病早期靈敏度低的大環境下，血清HE4樣本易收集且易于監測，能快速、經濟的反映早期CKD進展情況以及腎臟纖維化程度，可應用于非腫瘤CKD患者的預后推測和風險評估，作為早期診斷和預后評估的新型生物學標志物具有重要意義。但目前對其研究尚不充分，只是依據現有研究作出的理論推測，仍需要進一步通過臨床和實驗研究來驗證。此外，腎臟纖維化是加速腎功能惡化的主要原因，有研究報道[41]，HE4在纖維化過程中發揮著重要作用，抑制HE4可促進腎纖維化的改善，基于HE4介導腎臟纖維化進一步探討能否以HE4為靶點進行腎臟纖維化的防治并改善腎功能，為臨床提供了研究的新思路。