miR-129-3p與LPAR3在肝癌細胞中的表達水平及其靶向關系研究*

賈明君,王義真,常聰穎,張銀閣

1.邢臺市第二醫院肝病一科，河北邢臺 054000;2.邢臺市第三醫院肝膽外科，河北邢臺 054000

肝癌是發生在肝臟的惡性腫瘤，與飲酒、病毒性肝炎、食用霉變食物相關，患者早期常無特殊癥狀，是我國常見的惡性腫瘤之一[1-2]。我國肝癌患者年齡為40～50歲，男性比女性多見，高發于東南沿海地區，其病因和發病機制尚未明確[3-4]。研究表明表觀遺傳學尤其是微小RNA(miRNA)在肝癌的發生發展中發揮著重要的調控作用[5-6]，如miR-129家族的miR-129-5p可通過靶向鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅳ(CAMK4)抑制肝癌生長[7]，或可通過抑制Wnt信號通路減弱肝癌細胞的增殖并促進其凋亡[8],但miR-129-3p在肝癌中的表達水平情況尚不清晰。溶血磷脂酸受體3(LPAR3)和PI3K信號通路參與多種癌癥進展，LPAR3異常表達參與調控了卵巢癌等癌癥的耐藥性[9-10]，PI3K/AKT信號通路也參與了肝癌細胞的增殖、凋亡、侵襲等過程[11-12]，但miR-129是否可以通過靶向調控LPAR3并影響PI3K/AKT信號通路尚不清晰。因此，本研究將通過多種肝癌細胞系分析miR-129-3p和LPAR3的表達水平，探究其靶向關系，并通過裸鼠荷瘤實驗確定miR-129-3p對腫瘤發展及PI3K/AKT信號通路的影響，為miR-129-3p在肝癌的作用提供分子機制和理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料 人肝細胞及肝癌癌細胞株HL-7702、HepG2、BEL-7402、SMMC-7721購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

SPF級雌性裸鼠，(20±2)g，20只，購于北京科興中維生物技術有限公司[SYXK(京) 2019-0052]，18～22 ℃,濕度50%～60%，氨濃度≤20 ppm，換氣次數10～20次/小時，適應性飼養1周分為對照組和miR-129-3p組。

1.2儀器與試劑 RPMI-1640及DMEM購于美國gibico公司，胎牛血清和青鏈霉素購于澳大利亞Ausbian公司；10 cm培養皿、15 mL離心管、1.5 mL EP管等試驗耗材購于美國Corning公司；miR-129-3p質粒購于廣州Ribobio公司；miR-129-3p、LPAR3、PI3K及AKT引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成；ABI 7500 qPCR儀購于美國ABI公司；Western blot電泳儀購于美國bio-rad公司。

1.3方法

1.3.1qPCR檢測細胞及組織中miR-129-3p、LPAR3、PI3K、AKT表達 細胞采用1 mL Trizol 提取總RNA；腫瘤組織采用液氮中進行研磨，加入1 mL Trizol 提取總RNA；嚴格按照miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix Kit PCR試劑盒進行逆轉錄并通過qPCR儀進行表達水平檢測，所有操作在冰上進行并避免RNA酶污染。7500 Fast系統進行實時熒光定量PCR的條件：預變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，35個循環，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并提供，分別使用U6和GHAPDH分別作為內參，以2-ΔΔCt計算miR-129-3p、LPAR3、PI3K、AKT相對表達水平。見表1。

表1 qPCR檢測中不同基因的引物序列

續表1 qPCR檢測中不同基因的引物序列

1.3.2熒光報告酶實驗 MIRDB生物信息學軟件預測miR-129-3p在LPAR3上的結合關系，熒光素酶報告實驗驗證miR-129-3p與LPAR3基因的靶向關系，由廣州Ribobio公司構建并提供LPAR3野生型(WT)和突變型(MUT)報告基因質粒，并分別與miR-129-3p mimic或NC質粒轉染至細胞中。轉染48 h后，按照Dual Luciferase reporter Assay System說明書分別檢測螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶比值表示熒光素酶相對活性，實驗重復3次。

1.3.3細胞培養及轉染條件 各組細胞培養條件：RPMI-1640/DMEM完全培養液(內含10%胎牛血清、青霉素100 μg/mL、鏈霉素100 μg/mL )，置CO2培養箱內，5% CO2，37 ℃靜置培養；細胞轉染：用胰酶消化細胞后重選，嚴格按照轉染試劑盒lipo3000(11668-027，Invitrogen公司)說明書將NC和miR-129-3p質粒進行轉染，6～8 h后，更換成完全培養基重新加入完全培養基，置于5% CO2培養箱中37 ℃培養，用于后續各組實驗。

1.3.4裸鼠荷瘤實驗 將野生型人肝癌細胞HEPG2和轉染miR-129-3p的細胞調整至2×107個/毫升的細胞懸液。將所得細胞懸液以1 mL無菌注射器接種于20只裸鼠右側腋下皮下，注入細胞懸液每只裸鼠注射0.2 mL。對照組(n=10)注射野生型HEPG2細胞，miR-129-3p組裸鼠(n=10)注射轉染miR-129-3p的HEPG2細胞，7 d后測量腫瘤體積，建模成功的判斷標準:皮下瘤塊體積≥0.5 cm3，腫瘤生長達到標準的入組進入后續分組及實驗，成瘤后每3天用游標卡尺測量皮下瘤塊的長短徑，計算腫瘤體積=長徑×短徑2×1/2，連續21 d，繪制兩組裸鼠腫瘤生長曲線及每只裸鼠腫瘤生長曲線。

1.3.5Western blot 檢測蛋白表達 取適量腫瘤組織液氮下研磨，加入1 mL RIPA蛋白裂解液冰上提取細胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。加入5×SDS的蛋白上樣緩沖液95 ℃ 10 min煮沸后備用。將樣品分別加入不同的泳道進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓80 V 10 min，分離膠電壓120 V 1.5 h，后轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉。加入特異性一抗LPAR3 Antibody(1∶1 000，PA5-27074，Thermer fisher，美國)，PI3K Antibody(1∶1 000，ab125633，abcam，英國)，AKT(1∶1 000，ab8805，abcam，英國)和GAPDH(1∶10 000，ab8245，abcam，英國)于4 ℃冰箱過夜。TBST洗膜3次，每次5 min，加入特異性的羊抗兔二抗(1:2 000)，孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，采用ECL化學發光液曝光顯影，使用Photoshop圖像分析軟件系統進行半定量分析。

2 結 果

2.1miR-129-3p在肝組織和癌旁組織中的表達比較 如表2所示與對照組正常肝細胞相比，肝癌細胞HepG2、BEL-7402、SMMC-7721中miR-129-3p相對表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

表2 不同細胞系中miR-129-3p 和 LPAR3相對表達水平的比較

2.2miR-129-3p與LPAR3的靶向關系確定 生物信息學軟件MIRDB預測LPAR3為miR-129-3p具有靶向關系，進一步通過熒光報告實驗證實了在HL-7702、HepG2、BEL-7402、SMMC-7721 4種細胞系中miR-129-3p與LPAR3均具有靶向關系，差異具有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

注：A為HL-7702細胞；B為HepG2細胞；C為BEL-7402細胞；D為SMMC-7721細胞。

2.3miR-129-3p對裸鼠腫瘤生長的抑制作用 兩組裸鼠荷瘤后精神狀態均較好、活動頻繁、飲食飲水量正常。荷瘤第7天對小鼠進行篩選，各組有10只裸鼠腫瘤體積≥0.5 cm3且大小均一，成瘤率為71%，腫瘤體積未達到實驗標準的未入組本試驗。如圖2所示，miR-129-3p組裸鼠腫瘤體生長速度顯著低于對照組，腫瘤積顯著低于對照組，由此可見腫瘤生長受到顯著抑制，差異有統計學意義(P<0.01)。

注：A為腫瘤生長曲線；B為小鼠活體成像。

2.4腫瘤組織miR-129-3p、LPAR3、PI3K、AKT的表達水平 與對照組相比，miR-129-3p相對表達水平顯著升高，LPAR3、PI3K、AKT顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 qPCR檢測腫瘤組織miR-129-3p、LPAR3、PI3K、AKT相對表達水平

2.5腫瘤組織LPAR3、PI3K、AKT蛋白的相對表達水平 與對照組相比，miR-129-3p組腫瘤組織LPAR3、PI3K、AKT顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表4 腫瘤組織LPAR3、PI3K、AKT相對表達水平

3 討 論

肝癌是肝臟惡性腫瘤，可分為原發性和繼發性兩大類。原發性肝臟惡性腫瘤起源于肝臟的上皮或間葉組織，是我國高發的危害極大的惡性腫瘤；繼發性肝癌與原發性肝癌相比較較為少見，繼發性或稱轉移性肝癌系指全身多個器官起源的惡性腫瘤侵犯至肝臟，一般多見于胃、膽道、胰腺、結直腸、卵巢、子宮、肺、乳腺等器官惡性腫瘤的肝轉移[13-14]。MiRNA是多種癌癥發生發展的重要調控分子，尤其是參與了肝臟細胞分化和組織發育過程中的基因的轉錄后調控過程[15-16]。研究表明miR-129對肝臟疾病發展中具有調控作用，如miR-129-5p在非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者中顯著異常表達，并且異常表達的MiR-129-5p在NAFLD患者可能是一種潛在的診斷生物標志物[17],也有研究通過在碳CCl4大鼠模型證實了升高的miR-129-5p可通過PEG3的NF-κB信號通路減輕肝纖維化[18]。本研究通過3種肝癌細胞系及對照細胞系證實了miR-129-3p在3種肝癌細胞中均出現顯著低表達，提示miR-129-3p可能對肝癌細胞具有抑制作用，因此本實驗進行了裸鼠荷瘤實驗進一步探究過表達miR-129-3p是否會干預肝癌細胞在小鼠體內的增殖，結果證實轉染miR-129-3p的肝癌細胞在小鼠體內增殖顯著降低，腫瘤生長受到顯著抑制，由此提示：miR-129-3p對肝癌的發生發展具有顯著的抑制作用。

LPAR3主要位于細胞的細胞質中，編碼G蛋白耦聯受體家族以及EDG蛋白家族的一個成員。該蛋白作為溶血磷脂酸的細胞受體發揮作用，并介導溶血磷脂酸誘發的鈣動員。該受體主要與G(q/11)α蛋白結合可通過吸附miRNA影響基因表達，尤其可以激活RAS/MAPK和PI3K/AKT通路[10-19]。研究表明上調的miR-15b通過靶向LPAR3抑制PI3K/AKT通路，進而緩解卵巢癌[20]，但是miR-129-3p是否可以靶向LPAR3進而調控PI3K/AKT從而發揮抑制腫瘤作用上不明確，因此本研究首先通過生物信息學分析軟件DBmiR預測了miR-129-3p與LPAR3具有調控作用，本研究進一步在3種肝癌細胞和1種對照細胞中通過熒光報告實驗證實了miR-129-3p與LPAR3的靶向作用，由此證實在細胞水平上，miR-129-3p與LPAR3的調控作用。為了進一步在體內實驗中證實這種靶向調控關系，本文通過裸鼠實驗，分別荷瘤野生型HepG2和轉染miR-129-3p的HepG2細胞，證實了在過表達miR129-3p的小鼠腫瘤組織中，LPAR3出現了顯著低表達，這與細胞學實驗結果一致，進一步在體內實驗證明了miR-129-3p與LPAR3的靶向作用。由于LPAR3可以調控PI3K/AKT信號通路活性[20-21]，本研究探究了腫瘤組織中的PI3K/AKT表達水平，結果證實低表達LPAR3會抑制PI3K和AKT的mRNA及蛋白表達水平，由此推測在肝癌細胞中，miR-129的高表達會靶向LPAR3基因，調控PI3K/AKT信號通路，實現抑制腫瘤發展的作用。

綜上所述，本研究通過細胞學實驗和體內裸鼠荷瘤實驗證實了miR-129-3p在肝癌細胞中低表達，miR-129-3p可以通過靶向LPAR3，抑制PI3K/AKT信號通路，實現抑制腫瘤的發生發展的作用。本研究可以進一步獲取臨床樣本，探究miR-129-3p對LPAR3的靶向作用及下游信號通路的調控作用，完善miR-129-3p的調控機制和信號通路。