血清LncRNA NEAT1、LncRNA H19在NAFLD及肝纖維化疾病的臨床應用價值研究*

段雨函,吳 鋼

湖北省恩施州中心醫院臨床檢驗中心,湖北恩施 445000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)為肝臟脂質代謝異常的疾病，是最常見的導致慢性肝臟疾病的誘因之一[1]。NAFLD是主要特征為肝細胞內存在過多脂肪沉積的臨床病理綜合征，是一種獲得性代謝應激性肝損傷，與胰島素抵抗存在相關性[2]。肝細胞調查數據表明NAFLD是最常見的全球性慢性肝病，目前全球約有30%的人群均為NAFLD患者，且患病人數呈持續增加的趨勢[3]。NAFLD主要存在兩種類型：80%為單純性脂肪肝，是一種良性的臨床過程[4]。10%～20%為非酒精性脂肪性肝炎，是一種潛在的嚴重疾病，除了存在脂肪變性的情況，還有肝細胞炎癥以及肝纖維化[5]。肝纖維化是NAFLD向肝硬化和肝細胞癌發展的關鍵步驟，是肝臟內結締組織出現異常增生的病理過程[6]。有研究表明，長鏈非編碼RNA(LncRNA)在肝臟疾病的病理過程中發揮重要的調控作用，若表達失常可導致肝臟內脂質代謝異常[7]。隨著現代醫學技術的高速發展，LncRNA在肝臟方面的臨床研究逐漸深入。其中LncRNA NEAT1和LncRNA H19是LncRNA中的兩個家族成員，現為了探究LncRNA NEAT1、LncRNA H19與NAFLD及肝纖維化發病風險的相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取于本院2018年8月至2021年8月確診為NAFLD的85例患者作為研究對象，根據患者肝纖維化程度分為NAFLD輕度組(31例)、NAFLD中度組(32例)、NAFLD重度組(22例)。根據NAFLD嚴重程度分類標準分為輕度(肝臟密度輕微降低，脾、肝Ct值比值為0.7～1.0)；中度(肝血管不清，脾、肝Ct值比值為>0.5～<0.7)；重度(肝臟密度顯著降低，脾、肝Ct值比值為≤0.5)。納入標準：(1)符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[8]中的診斷標準；(2)重要器官功能正常。排除標準：(1)酒精性、病毒性肝病；(2)藥物性肝炎；(3)合并感染、免疫系統疾病或其他系統的惡性腫瘤。NAFLD輕度組(31例)中男15例，女16例，平均年齡(46.23±12.62)歲；NAFLD中度組(32例)中男18例，女14例，平均年齡(44.95±13.28)歲；NAFLD重度組(22例)中男12例，女10例，平均年齡(45.46±11.39)歲。另選擇本院同期進行健康體檢的68例體檢健康者作為對照組，其中男38例，女30例，平均年齡(47.28±12.58)歲。4組研究對象性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會同意。

1.2方法 (1)采集NAFLD輕度組、中度組、重度組及對照組清晨空腹時的肘靜脈血5 mL，以3 000 r/min的速度離心15 min，取上清液1 000 μL，采用化學免疫發光法進行肝纖維化指標[Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、層黏連蛋白(LN)、透明質酸(HA)]檢測，所用試劑盒(北京晶美生物工程有限公司)嚴格按照說明書進行使用。(2)采用新型總RNA抽提試劑TRIzol(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)對4組患者血清標本中的總RNA進行提取。使用AMV試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)對提取得到的總RNA進行反轉錄，得到cDNA，再以cDNA為模板，使用7500型實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 公司，美國)進行反轉錄-聚合酶鏈式擴增(RT-PCR)。引物序列如下：LncRNA NEAT1上游引物正向：5′-GUC UGU GUG GAA GGA GGA ATT-3′，下游引物反向：5′-UUC CUC CUU CCA CAC AGA CTT-3′。LncRNA H19上游引物正向：5′-CCT CTA GCT TGG AAA TGA A-3′，下游引物反向：5′-GAC GTG AGA AGC AGG ACA T-3′。采用2-ΔΔCt方法進行數據分析，得到患者血清中的LncRNA NEAT1和LncRNA H19的表達水平。

2 結 果

2.14組研究對象肝纖維化指標比較 對4組研究對象的肝纖維化指標進行比較，得到NAFLD患者血清中PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平由小到大依次為NAFLD輕度組、中度組、重度組，且均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組研究對象肝纖維化指標比較

2.24組研究對象血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表達水平比較 對4組研究對象血清中的LncRNANEAT1、LncRNAH19表達水平進行比較，可得NAFLD輕度組患者的LncRNANEAT1表達水平最低，其次是中度組患者，表達水平最高的是重度組，且3組表達水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。NAFLD輕度組患者的LncRNAH19表達水平最低，其次是中度組患者，表達水平最高的是重度組，且3組表達水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 4組研究對象血清中LncRNA NEAT1、LncRNA H19的表達比較

2.3血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19表達水平與肝纖維化指標相關性 經Spearman相關性分析可知，LncRNANEAT1與NAFLD患者肝纖維化指標PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平均呈正相關(P<0.05)；LncRNAH19與NAFLD患者肝纖維化指標PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平均呈正相關(P<0.05)。見表2。

表2 血清中LncRNA NEAT1、LncRNA H19表達與肝纖維化指標相關性

2.4ROC曲線分析 經ROC曲線分析可得，LncRNANEAT1、LncRNAH19診斷NAFLD的截斷值分別為3.22、1.71；診斷的曲線下面積(AUC)分別為0.790、0.734、0.880。見圖2、表3。

圖2 NAFLD診斷ROC曲線圖

表3 血清中LncRNA NEAT1、LncRNA H19表達水平診斷NAFLD的價值

3 討 論

NAFLD是一種代謝應激性的肝臟損傷，與胰島素抵抗以及遺傳易感存在密切相關性，其病理變化過程與酒精性肝病相似，但患者無過量飲酒史。研究證明，NAFLD患者常有糖尿病、高血壓、高血脂等代謝綜合征伴隨出現，若不注意防護，極易發展為肝硬化甚至肝細胞癌[10]。有數據表明，近年來我國的NAFLD發病率越來越高，且發病人群也越來越年輕[11]。肝癌早期無特異性臨床癥狀，晚期卻無有效治療手段，因此防治NAFLD發展為肝癌也是降低肝癌死亡率的有效方法。NAFLD目前的發病概率已經明顯高于酒精性、病毒性肝病，但其發病機制還有待探究，研究認為其與基因、生活習慣及環境等因素存在相關性[12]。NAFLD患者肝內脂肪酸有60%均來自于組織中，其余均來自肝內脂肪和日常飲食，在患者病理變化過程中，肝細胞長期浸潤于脂質中會出現細胞變性、凋亡，最終轉化成肝纖維化，導致肝硬化[13]。因此，NAFLD的早期診斷非常重要，臨床上有越來越多的研究聚焦于通過血清標志物對NAFLD進行診斷和評估[14]。幾乎所有的慢性肝損傷均會轉化為肝纖維化，該過程是由肝實質、肝星狀及肝竇內皮細胞等一系列涉及細胞因子相互作用所引導[15]。有研究認為通過對患者的肝纖維化指標檢測可診斷NAFLD的嚴重程度，肝纖維化指標包括PCⅢ、CⅣ、HA及LN，均為血管及細胞的重要組成部分，可靈敏地反映患者肝纖維化情況[16]。

LncRNA是一組RNA分子，并且該RNA分子無法編碼蛋白。2007年，有研究報道一條功能性長編碼RNA，可以通過修飾染色質，參與基因的轉錄，該研究說明LncRNA有可能對基因表達發揮調控作用[17]。已有研究表明，LncRNA在調控纖維化因子的同時，也受到纖維化因子的調控，LncRNA的異常表達導致肝纖維化的產生[18]。LncRNANEAT1最早發現于分泌腺腫瘤中，接著又有研究發現肺癌組織中LncRNANEAT1出現過度表達，且與腫瘤的分期、轉移、預后差等臨床病例特征存在相關性[19]。當LncRNANEAT1表達水平降低時，腫瘤細胞的增殖和侵移受到明顯抑制。研究發現LncRNAH19過度表達加重肝纖維化，該通路主要是對膽汁酸代謝進行調控[20]。膽汁酸代謝出現異常時，高濃度的膽汁酸對上皮細胞產生損害，導致肝細胞于高濃度膽汁酸中暴露，進而巨噬細胞浸潤，最終肝細胞死亡。

本文對4組研究對象的肝纖維化指標進行比較，可得到血清中的PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平最高的均是NAFLD重度組，其次是中度組，再是輕度組，最低的是對照組。PCⅢ、CⅣ、LN、HA均為細胞和血管的生成物，當患者肝纖維化程度越高時，其水平升高促進細胞分化增殖和新生血管的形成。通過對4組研究對象血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表達水平比較可得，NAFLD重度組患者血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表達水平均為最高，其次是NAFLD中度組患者，再是NAFLD輕度組患者，表達水平最低的是對照組患者。由此說明，LncRNANEAT1、LncRNAH19的表達水平越高，NAFLD患者的病情越嚴重。LncRNANEAT1對肝纖維化因子進行調控，當患者NAFLD病情加重時，LncRNANEAT1表達水平升高發揮作用。LncRNAH19在NAFLD患者體內通過過表達，對還原性輔酶Ⅱ氧化酶4進行調節，從而發揮保護肝功能及肝損傷的作用。經過Spearman相關性分析，得到血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表達水平與NAFLD患者臨床肝纖維化指標PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平均呈正相關。說明，血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表達水平越高，則NAFLD患者的肝纖維化程度越嚴重。當患者出現肝纖維化時，機體通過提高血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表達水平，對患者肝細胞的增生與分化發揮調控作用，從而保護肝功能，避免進一步發展為肝硬化、肝細胞癌。經過ROC曲線分析可以得到，LncRNANEAT1診斷NAFLD的截斷值為3.22，AUC為0.790；LncRNAH19診斷的截斷值為1.71，AUC為0.734；二者聯合診斷的AUC為0.880。比較可以得到將兩個指標聯合檢測，可提高診斷NAFLD及肝纖維化的特異度及靈敏度。本研究也存在一些不足，如樣本量較小等，需在以后的研究中對其進行擴大，使研究結果更有參考意義。

綜上所述，NAFLD患者病情惡化，血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19水平及肝纖維化指標PCⅢ、CⅣ、LN、HA的表達水平均隨之升高。血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表達水平與肝纖維化指標PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平呈正相關。患者血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表達水平可用于診斷患者病情，二者聯合診斷價值更高。