肝癌患者WNT通路分子C-myc和β-catenin表達水平與惡性程度的關系分析*

馮 喆,檀喜玲,高 芳

1.邯鄲市中心醫院普外科，河北邯鄲 056001;2.邯鄲市人民醫院消化內科，河北邯鄲 056009;3.邯鄲市第一醫院普外科，河北邯鄲 056002

肝癌是全球最常見的癌癥死亡原因，發展中國家的肝病發病率更高，其風險因素包括乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、脂肪肝、酒精相關肝硬化、吸煙、肥胖、糖尿病、鐵超載和各種飲食暴露[1-2]。約有5%～15%的肝癌患者可以接受手術切除，但患者的預后較差[3]。肝癌的發生中伴隨著多種基因的異常表達和信號通路的調控，細胞學研究表明WNT信號通路在肝癌的進展中發揮著重要調控作用,WNT/β-連環蛋白信號的異常促進了肝癌的發展和進展，原發性肝癌如肝細胞癌(HCC)和膽管癌(CCA)均與WNT信號通路的關鍵分子的異常表達有關[4-5]。C-myc癌基因是WNT信號通路的重要分子，與多種腫瘤發生發展有關[6]，研究表明通過下調C-myc表達水平可以抑制肝癌細胞的增殖分化和遷移，也有研究表明肝癌細胞C-myc的表達水平與腫瘤微環境T細胞的激活和殺傷調控有關，可以通過與免疫系統的相互作用對肝癌細胞的增殖凋亡發揮調控作用[7-8]，但當前研究多集中于細胞表達水平的研究，臨床上C-myc的表達水平與肝癌患者的關系研究較少，尤其是與肝癌惡性程度相關性研究較少。β-連環蛋白(β-catenin)是一種多功能蛋白，是WNT通路的重要信號分子，通過與細胞骨架的相互作用協助細胞對細胞外的信號和影響作出反應。研究表明Wnt/β-catenin信號通過依賴CTNNBIP1的方式驅動激活和肝腫瘤細胞的進展，β-cateni的翻譯也可以受到crRNA的調控促進肝癌細胞生長[9-10]，然而β-catenin的表達是否與臨床肝癌的分期、病理程度相關尚不明確。因此本研究將通過臨床獲取的肝癌患者肝癌組織以及相應對照組織，探究組織中C-myc與β-catenin的表達水平與臨床患者AFP表達水平、腫瘤包膜情況、分化程度、臨床分期、組織學類型及預后的關系進行分析，為肝癌篩查及預后預判提供可能的分子生物標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2022年1月于邯鄲市中心醫院原發性肝癌患者84例，作為觀察組，年齡36～79歲，平均(59.2±10.4)歲,臨床收集手術后的肝癌病理存樣樣本用于本研究，另收集肝硬化及乙型肝炎患者共60例作為對照組，年齡35～77歲，平均(59.8±9.6)歲。本研究患者納入標準：(1)病理診斷明確為肝癌的患者；(2)所有患者術前未接受放化療、抗腫瘤藥物治療及其他治療；(3)腫瘤未發生遠處轉移患者；(4)臨床資料及病理資料完整患者。排除標準：(1)心臟、肝臟、腎臟等器官具有器質性功能障礙的患者；(2)術前接受放療、化療及其他治療的患者；(3)腫瘤發生遠處轉移的患者；(4)臨床資料及病理資料不完整的患者；(5)合并有全身性疾病的患者；(6)自身免疫功能障礙的患者。本研究中所有參與者均簽署知情同意書并通過醫院倫理委員會審核。

1.2儀器與試劑 二甲苯購于濟南鳳鳴化工有限公司、無水乙醇、甲醇購于天津市化學試劑研究所有限公司，過氧化氫購于河南億豐化學有限公司，DAB 顯色試劑盒(貨號：DA1010) 購于美國Solarbio公司，封閉血清(貨號：SL050)購于美國Solarbio公司；Motic 全自動沉降式制片系統，型號：Motic(型號Asps)，DZK-6050臺式真空烘箱購于上海篤特科研儀器有限公司，Primo Star iLED顯微鏡購于德國蔡司公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學染色 將組織標本置于10% 中性甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟標本經切片機切為4 μm 連續切片，蒸餾水漂洗后將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%乙醇-100%乙醇-95%乙醇-90%乙醇-80%乙醇-70%乙醇進行脫蠟，在清水中沖洗，加入3%H2O2浸泡10 min，去內源性的過氧化氫酶，于清水中洗兩次，加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3 min，冷卻至室溫后，去除檸檬酸緩沖液，清水洗2次，并將載玻片置于PBS中5 min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，用血清封閉樣本非特異性的位點，置于37 ℃溫箱中30 min，將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清，加入特異性一抗Anti-C-myc antibody (貨號：ab32072，英國abcam公司，稀釋比1∶100)和Anti-beta Catenin antibody (貨號ab32572，英國abcam公司，稀釋比1∶250)，將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5 min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗，然后置于37 ℃溫箱中30 min，DAB顯色并復染，與顯微鏡下觀察，確定病理陽性程度，病理判定陽性標準如表1所示。

表1 蛋白免疫組織化學檢測的臨床診斷標準

1.3.2研究方法 完整收集本研究所需的所有肝癌患者的臨床基本信息，包括性別、年齡、乙型肝炎病毒感染情況、血清甲胎蛋白(AFP)檢測水平、腫瘤最大徑、腫瘤數目、腫瘤分化程度、腫瘤包膜情況、臨床分期判定、病理類型分型、肝內外轉移及術后3年隨訪生存情況。

2 結 果

2.1入組樣本C-myc和β-catenin陽性率的分析 觀察組C-myc和β-catenin陽性率均顯著高于對照組，差異有統計學意義 (P<0.01)。見表2。

表2 兩組C-myc和β-catenin陽性率比較[n(%)]

2.2入組樣本C-myc和β-catenin陽性率與肝癌臨床病理資料的關系 C-myc和β-catenin陽性率在不同性別、年齡、腫瘤最大徑、腫瘤數目及是否合并乙型病毒感染患者之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，而不同AFP水平、包膜完整程度、腫瘤分化程度、臨床分期水平、病理類型分型與患者的C-myc和β-catenin陽性率相關，差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 C-myc和β-catenin與肝癌臨床病理參數的關系[n(%)]

續表3 C-myc和β-catenin與肝癌臨床病理參數的關系[n(%)]

2.3不同生存率患者C-myc和β-catenin陽性率分析 入組的肝癌患者均進行3年隨訪，結果表明肝癌患者1、2、3年生存率分別為71.31%、52.35%、36.20%，隨患者生存時間的延長，C-myc和β-catenin陽性率降低，隨訪3年存活的患者C-myc和β-catenin陽性率顯著高于1年生存與2年生存的患者，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 不同生存率患者C-myc和β-catenin陽性率的比較分析[n(%)]

3 討 論

肝癌是肝臟惡性腫瘤，原發性肝癌多起源于肝臟的上皮或間葉組織，肝癌主要發病原因為慢性乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染[11]。中國的肝癌發病率占全球肝癌發病率的一半以上，建立公共無煙環境，減少吸煙與二手煙暴露，還有控制肥胖和改善生活方式，積極開展腫瘤篩查等，可顯著降低肝臟癌癥疾病負擔[12]。肝癌早期通常沒有明顯的癥狀，因此患者發現的時候大多數已經處于中晚期，探究肝癌的診斷標志物和特異性表達分子對臨床具有重要意義。當前通過基因組學、轉錄組學篩選的大量肝癌惡性程度相關基因，但結合臨床數據進行大數據分析對肝癌發生機制的各種分子生物學、遺傳學和免疫組織化學研究較少；因此，確定肝癌發生發展過程中特異性表達的分子作為診斷、預后和預測性生物標志物具有較好的研究價值和應用前景[13-14]。

WNT信號通路分子C-myc和β-catenin在肝癌進展中會發生異常表達，是肝細胞再生所必需的，并且在肝細胞穩態、細胞更新過程、血管分泌調節中發揮關鍵作用，Wnt/β-catenin信號通路參與肝臟疾病進展的所有階段,從最初的肝損傷到炎癥、纖維化、肝硬化以及腫瘤的發生及進展均有所參與，異常的Wnt/β-catenin信號會促進包括癌癥在內的不同肝臟疾病的發生和進展[15]，細胞學實驗證實肝癌細胞中C-myc的表達水平可以受到ACSL4/SREBP1途徑的調控，從而對重組肝癌細胞中的脂肪酸代謝產生影響[16]，也有研究證實C-myc是調控肝癌細胞增殖分化的靶向基因，prostate 1的六種跨膜上皮抗原通過靶向肝癌細胞中的C-myc加速肝癌細胞增殖與分化[17]，臨床實驗通過多組學聯合分子篩選重要特征分子，發現C-myc和wnt/β-catenin通路是主要富集的信號通路[18]，β-catenin可以受到PPARγ共激活因子-1α的調控，通過PPARγ依賴的WNT/PDK1抑制Warburg效應抑制肝癌轉移[19],β-catenin也可以通過KIF2C/mTORC1信號參與肝癌的轉移，并且與患者的不良預后相關[20]，但與高甲胎蛋白水平、無包膜或包膜不完整、低中分化腫瘤、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、病理類型等完善的病理分析的關系上未得到充分的研究，因此本研究通過臨床收集臨床資料詳盡的84例肝癌患者，采用免疫組化分析C-myc和β-catenin的陽性表達水平與原發性肝癌患者肝癌的惡性程度、臨床分級、轉移及患者的預后關系，證實了本研究發現，原發性肝癌患者C-myc和β-catenin陽性率較肝硬化及肝炎患者高，且C-myc和β-catenin陽性率與肝癌病理類型、臨床分期、分化程度、腫瘤包膜情況均存在一定關系，表明C-myc和β-catenin可能參與肝癌患者腫瘤的浸潤生長過程。其機制為:癌細胞與內皮細胞產生黏附作用，進而通過內皮細胞間隙移行至內皮下導致腫瘤轉移，其對應配體可與癌細胞表面整合素結合，促進癌細胞黏附，由于WNT信號通路會對基質金屬蛋白酶2(MMP2)和MMP9進行調控[21]，促進MMP降解基質，導致癌細胞向間質浸潤，引起腫瘤轉移，同時本研究通過對患者進行了3年的跟蹤隨訪發現，隨患者生存率的提升，其癌組織C-myc和β-catenin陽性率均降低，提示二者可能存在負相關關系，表明上述各因子異常表達均參與原發性肝癌發病及病理過程，同時可能對肝癌患者預后有預測作用。

綜上所述，本研究證實肝癌組織中C-myc和β-catenin陽性率與原發性肝癌患者 AFP 水平、腫瘤包膜情況、分化程度、臨床分期、組織學類型及預后均有一定關系，且可能參與肝癌的侵襲、轉移。本研究可以進一步擴大樣本量，繪制受試者工作特征曲線，分析靈敏度和特異度，探究C-myc和β-catenin作為分子標志物的可能性，為臨床早診或預測肝癌患者的生物學標志物提供基因集，并為臨床診斷和治療提供新思路。