ABCG1介導的膽固醇外流在SLE患者中的作用及機制研究*

寇艷婷,朱星星,李 莉,原江水△

1.大連醫科大學研究生院，遼寧大連 116044；2.青島市市立醫院檢驗科，山東青島 266071;3.青島大學青島醫學院臨床醫學系，山東青島 266073

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種累及多器官的自身免疫性結締組織病，好發于育齡期女性。SLE患者易并發血脂代謝異常，SLE相關性的心血管系統疾病是SLE患者主要死亡原因之一[1-2]。ATP結合盒轉運蛋白G1(ABCG1)是一種跨膜轉運蛋白，由巨噬細胞廣泛表達，在促進膽固醇和磷脂外流到高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)的過程中起關鍵作用。本研究通過檢測合并心血管并發癥SLE患者和未合并心血管合并癥的SLE患者中ABCG1介導的膽固醇外流能力(CEC)的變化，探討ABCG1介導的膽固醇外流途徑在SLE患者心血管疾病高發中可能的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2021年10月在青島市市立醫院(下稱本院)就診的 SLE 患者73例作為SLE組，按是否合并心血管并發癥分為合并心血管并發癥患者40例(SY組)，未合并心血管并發癥患者33例(SN組)，其中男12例，女61例，年齡16～83歲，平均(44±16)歲。納入標準：患者均符合2009年美國風濕病學會制訂的SLE診斷標準[3]。排除標準：排除存在感染、腫瘤及其他自身免疫性疾病的患者。選擇同期在本院進行健康體檢的52例體檢健康者作為對照組(HC組)。其中男23例，女29例，年齡23～81歲，平均(43±15)歲。SLE組和HC組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。標本采集經研究對象知情同意及本院倫理委員會審查批準。

1.2儀器與試劑 美國ABI熒光定量PCR循環儀；美國Invitrogen公司的TRIzol總RNA提取試劑(貨號15596-026)和Lipofectamine 3000(貨號L3000015)；中國江蘇凱基生物技術股份有限公司的0.1% DEPC Water(貨號KGDN4500)和CHO-K1細胞；日本TaKaRa公司的cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號RR036B)和One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ(SYBR Green)(貨號RR086B)；美國Corning Incorporated公司的6 well-cell culture plate(貨號3516)；英國abcam公司的膽固醇外流分析試劑盒(貨號ab196985)；美國Gibco公司的DMEM培養基(貨號C11995500BT)。

1.3方法

1.3.1pcDNA3.1(+) -ABCG1過表達載體構建及轉染 通過逆轉錄-聚合酶鏈反應在(RT-PCR)擴增獲得ABCG1目的基因片段，擴增產物大小1 671 bp，產物以1%瓊脂糖凝膠電泳,產物回收純化按試劑盒說明書進行，將回收純化后的產物及 pcDNA3.1(+) 載體分別通過Hind Ⅲ、EcoR I酶切,然后進行連接、轉化，PCR鑒定重組克隆(F：5′-CCG GGG AAA GGT CTC GAA TC-3′，R：5′-CGC AGG GTT GTG GTA GGT AG-3′)，測序比對經酶切驗證的陽性克隆證實構建成功。將處于對數生長期的CHO-K1細胞接種于6孔板中，細胞密度達到70%～80%時采用Lipofectamine 3000將pcDNA3.1(+) -ABCG1過表達載體轉染CHO-K1細胞，培養4～6 h后進行RT-PCR鑒定，更換新鮮培養基，將培養板置于37 ℃的含5% CO2培養箱中繼續培養48 h，用于后續實驗。

1.3.2血漿標本的采集及準備 清晨空腹靜息狀態下采集肘靜脈血，使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，經4 ℃、3 000 r/min離心10 min后取上清液，保存于-80 ℃冰箱內備用。

去除ApoB血漿的制備：100 μL血漿中加入40 μL的PEG溶液(20%PEG，200 mmol/L的甘氨酸緩沖液，pH 7.4)，沉淀血漿中含有ApoB的脂蛋白。孵育20 min后，于4 ℃ 10 000 r/min離心30 min沉淀，收集含有HDLC的上清液，處理后的血漿用于后續的膽固醇外流實驗。

1.3.3血脂水平檢測 脂代謝指標由本院檢驗科采用Beckman Au5821生化分析儀及相應配套試劑盒檢測血漿三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、HDLC、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC) 、非高密度脂蛋白膽固醇(non-HDLC)。non-HDLC計算公式:non-HDLC=TC-HDLC。

1.3.4膽固醇外流率測定 CHO-K1細胞和ABCG1高表達CHO-K1細胞以1×106個細胞接種于96孔板，培養2 h后待細胞貼壁后去除培養基，將50 μL的Labeling Reagent和50 μL的Equilibration Buffer混勻后，每孔加入100 μL孵育16 h，去除上清，用200 μL培養基緩慢清洗細胞，分別在培養基中加入2.8%的去除ApoB脂蛋白的血漿孵育4 h，收集上清液，測量熒光強度(Ex/Em=482/515 nm)。用100 μL細胞裂解液裂解單層細胞，并用振蕩器室溫振蕩30 min，使單層細胞完全裂解，并測量裂解液的熒光強度(Ex/Em=482/515 nm)。膽固醇外流率=上清液熒光強度/(上清液熒光強度+裂解液熒光強度)×100%。

2 結 果

2.1各組基本情況及脂代謝指標 SLE組的脂代謝指標，與HC組相比較，TG、TC、HDLC水平差異無統計學意義(P>0.05)；SLE組的LDLC、non-HDLC水平均高于HC組，差異有統計學意義(P<0.05),見表1。SY組的脂代謝指標，與SN組相比較，TC、HDLC、LDLC水平差異無統計學意義(P>0.05)，TG水平顯著高于SN組，差異有統計學意義(P<0.05)，non-HDLC水平顯著低于SN組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 SLE組與HC組的基本情況與血脂指標比較[M(P25～P75)或

表2 SY組與SN組的基本情況與血脂指標比較[M(P25～P75)或

2.2膽固醇外流率分析

2.2.1各組在ABCG1/CHO-K1細胞與CHO-K1細胞中膽固醇外流率分析 HC組中，與CHO-K1細胞(21.37%±0.40%)相比較，ABCG1/CHO-K1細胞膽固醇外流率(28.49%±0.68%)明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05,t=9.955)；SLE組中，與CHO-K1細胞(34.36%±3.12%)相比較，ABCG1/CHO-K1細胞膽固醇外流率(38.75%±2.24%)明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05,t=2.798)；SY組中，與CHO-K1細胞(37.14%±1.05%)相比較，ABCG1/CHO-K1細胞中膽固醇外流率(40.54%±0.95%)明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05,t=4.174)；在SN組中，與CHO-K1細胞(31.58%±0.31%)比較，ABCG1/CHO-K1細胞膽固醇外流率(36.96%±1.43%)明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05,t=6.346)。見圖1。

注:*P<0.05。

2.2.2HC組和SLE組在CHO-K1細胞中膽固醇外流率分析 CHO-K1細胞中，與HC組(21.37%±0.40%)相比較，SLE組的膽固醇外流率(34.36%±3.12%)明顯增高，差異有統計學意義(P<0.01，t=10.032)；與SN組(31.58%±0.31%)相比較，SY組(37.14%±1.05%)膽固醇外流率明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05，t=8.781)。見圖2。

注:*P<0.05。

2.2.3HC組和SLE組在ABCG1/CHO-K1細胞中膽固醇外流率分析 ABCG1/CHO-K1細胞中，與HC組(28.49%±1.17%)相比較，SLE組的膽固醇外流率(38.75%±2.24%)明顯增高，差異有統計學意(P<0.05,t=7.265)；與SN組(36.96%±1.43%)相比較，SY組(40.54%±0.94%)膽固醇外流率明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05,t=3.616)。見圖3。

注:*P<0.05。

3 討 論

SLE作為一種累及多臟器、多系統的復雜的自身免疫性慢性結締組織疾病，SLE發病與遺傳和環境多種因素相關，中國SLE 患病率為 70/100 000，女性患病率為113/100 000[4-5]。SLE的死因呈雙峰模式，早期主要是疾病本身所致的器官衰竭和感染，晚期死因是心血管系統疾病，已有研究發現，與普通人群相比，SLE患者呈現出更高的心血管系統疾病的死亡率，其中缺血性卒中和心肌梗死的發生率是健康人群的3倍[6]。脂代謝異常與SLE心血管合并癥的發生密切相關，SLE患者中存在以TG水平升高和HDLC水平降低為主的脂質代謝紊亂[7]。有研究發現動脈粥樣硬化患者的血脂指標與未發生動脈粥樣硬化病變者相比較，TG、TC、LDLC水平偏高，HDLC水平偏低[8]。眾所周知，育齡期的健康女性與年齡匹配的男性相比，患心血管疾病和冠心病的風險較低。但是，在SLE女性患者中，血脂異常的特征是LDLC水平升高和HDLC水平降低，消除了健康女性觀察到的性別特異性的心血管疾病保護作用，此外過度激活促炎途徑和某些SLE藥物對脂質代謝的影響，所有這些都最終導致SLE患者的脂質譜改變[9]。動脈粥樣硬化病變者血脂譜與SLE患者血脂譜相符合，提示脂代謝紊亂與SLE合并動脈粥樣硬化相關。

膽固醇逆向轉運(RCT)是機體清除過剩膽固醇的重要途徑，對機體維持膽固醇穩態有重要意義。其中ABC轉運蛋白家族介導的膽固醇外流是RCT途徑之一，也是RCT關鍵的限速步驟。該途徑包括ATP結合盒轉運蛋白A1(ABCA1)和ABCG1的活性膽固醇外流。ABCA1介導從巨噬細胞流出的膽固醇和磷脂分子被無脂載脂蛋白ApoA-I接受，這是HDLC主要蛋白質部分，而ABCG1介導膽固醇流出至HDLC以進一步成熟[10-11]。ABCA1和ABCG1介導的膽固醇轉運在很大程度上決定了細胞內膽固醇生理水平。ABCG1作為ABC轉運蛋白家族的一員，有關其在動脈粥樣硬化中的作用卻一直存在爭議。

SLE患者產生大量自身抗體和免疫復合物形成，并且自身抗原失耐受，其中dsDNA抗體可識別多種自身抗原，觸發細胞凋亡、炎癥反應和引起組織纖維化[12]，SLE患者炎癥狀態擾亂機體膽固醇代謝穩態，與脂代謝異常及發生動脈粥樣硬化之間的關系復雜。SLE患者的自身致病性抗體也是神經精神性紅斑狼瘡(NPSLE)發病的主要介質，NPSLE為影響SLE患者預后的主要因素之一[13]。

本研究發現在ABCG1表達上調的CHO-K1細胞中，在HC組、SY組和SN組中，細胞的膽固醇外流率均明顯增加，說明ABCG1在膽固醇外流中可能起到促進作用，這與在ABCG1低表達的巨噬細胞中7-KC和7β-OHC膽固醇外流減少，胞內氧化固醇沉積增加[14]的研究結果在理論上具有一致性；TARLING 等[15]發現 ABCG1 基因敲除小鼠動脈粥樣硬化病變區域粥樣斑塊體積縮小，巨噬細胞凋亡增加，提示ABCG1 低表達造成胞內氧化固醇堆積，加速細胞凋亡，這可能是機體抗動脈粥樣硬化的相關機制。在多個動物及臨床研究中，ABCG1對動脈粥樣硬化的作用，結果并不一致，目前仍存在爭議[16]，本研究發現在ABCG1高表達的CHO-K1細胞中，SLE組膽固醇外流率明顯增高，另外與SN組相比，SY組膽固醇外流率明顯增高。

本研究基于去除ApoB血清CEC的研究，主要反映高密度脂蛋白的活性，高密度脂蛋白不僅反映血管中的脂質沉積情況，也對巨噬細胞和內皮細胞的炎癥和免疫功能調節起重要作用[17]。SLE患者體內存在脂質代謝紊亂，血脂水平較健康者明顯增高，研究表明SLE患者存在抗HDLC抗體及HDLC的結構和功能異常，導致SLE血脂譜主要表現為高TG、LDL、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDLC)水平和低HDLC水平，血脂水平的增高可能與SLE患者中膽固醇外流率增加有一定的關系，但HDLC結構和功能上的變化對SLE患者膽固醇外流的影響及機制尚需要進一步的研究。

國內外學者對ABCG1在膽固醇外流及動脈粥樣硬化中的研究結果不完全一致，近年有研究證實PPARγ表達與激活和膽固醇的外轉運密切相關，可以促進ABCG1的表達上調，從而抑制泡沫細胞的形成，具有抗動脈粥樣硬化的作用[18]。一項PPARγ改善結核分枝桿菌通過ABCG1依賴性膽固醇外流途徑誘導泡沫細胞形成的研究表明PPARγ通過調節ABCG1表達參與改善泡沫狀巨噬細胞形成[19]。因此，關于ABCG1介導的膽固醇外流途徑在機體抗動脈粥樣硬化疾病中特別是在心血管并發癥高發的SLE等自身免疫性疾病中的功能及作用機制都需要進一步的深入研究，從而為臨床SLE等自身免疫性疾病中心血管合并癥高發提供良好的理論基礎和診斷、治療依據。