芒果苷對亞硒酸鈉所致大鼠白內障的影響

高睿騏，趙鳳瓊，楊莉，龔波

白內障是指由各種病因引起的晶狀體混濁，是導致失明的主要原因，患者的視力和生活質量可能會嚴重受損[1]。目前白內障的標準治療方法是外科手術，即摘除不透明的晶狀體，代之以人工晶體，但仍有許多患者不適用手術。因此，需要開發一種非手術干預方法，預防或延遲白內障的發生。亞硒酸鈉白內障模型是研究年齡相關性核性白內障的一種快速、清晰、穩定的嚙齒動物模型，可模擬人類白內障的反應[2-3]。因此，亞硒酸鈉誘導的白內障動物模型廣泛用于醫學實驗中，以篩選和評估抗白內障藥物的治療潛力。雖然白內障的形成機制尚不完全清楚，但年齡相關性白內障的形成與自由基相關的氧化應激有關[4]。許多研究[5-6]表明，抗氧化劑的補充可以成功預防氧化應激相關的白內障形成。芒果苷（mangiferin）是從芒果的葉子、樹皮、果皮和根中提取的天然多酚化合物，現代藥理學研究[7]已發現，芒果苷具有多種藥理學作用，主要有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等。根據芒果苷具有的優異生物活性，本研究探討補充芒果苷對亞硒酸鈉誘導的大鼠白內障的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40 只新生9 d 齡的Wistar 大鼠購自山東濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[許可證號：SCXK（魯）2021-0003]。在實驗期間，將大鼠飼養于室溫下，分別給予光照和黑暗12 h，自由獲得食物和水。本研究實驗動物及條件符合國家科學技術委員會的《實驗動物管理條例》相關規定，由都江堰市人民醫院動物實驗福利倫理審查委員會獲批（倫理審批號：JLZYLL201832）。

1.2 藥品、試劑與儀器

芒果苷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，M114062），亞硒酸鈉（美國Sigma 公司，214485），還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，E-EL-0060c、E-EL-0026c），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（中國賽默飛世爾科技有限公司，A53225、BMS2279）。

酶標儀（美國Biotek 公司，EON），分光光度計（美國Perkin Elmer 公司，AA-3100），高速冷凍離心機（美國Sigma公司，3K15）。

1.3 建立大鼠亞硒酸鈉白內障模型

將30只大鼠以2.46 mg/kg的劑量一次性皮下注射亞硒酸鈉構建大鼠白內障模型，另將10只大鼠皮下注射等量0.9%氯化鈉注射液。根據晶狀體混濁程度判斷造模的效果。

1.4 分組與給藥

造模成功的大鼠根據隨機數字表法隨機分為模型組（model group，MG）、芒果苷低劑量組（lowdose mangiferin group，L-MAN）及芒果苷高劑量組（high-dose mangiferin group，H-MAN），每組10 只。另將腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液的10 只大鼠設置為對照組（control group，CG）。L-MAN 與HMAN 組大鼠在造模1 h后，進行芒果苷腹腔注射，劑量分別為10 mg/kg 與40 mg/kg，CG、MG 組腹腔注射同體積0.9%氯化鈉注射液，連續7 d。21 d 后，檢查大鼠白內障的發生情況，并根據其混濁程度進行分級。

1.5 白內障形成評價

用0.5%托吡卡胺滴眼液和2.5%去氧腎上腺素注射液散大瞳孔，由眼科醫生確定白內障分級。白內障分為0～6 級[8]，0級為正常透明晶狀體；1級為晶狀體后囊膜下或囊膜混濁的初始征象；2 級為囊膜混濁，后囊膜下纖維腫脹或散在病灶；3 級為彌漫性囊膜混濁伴皮質散射；4 級為部分囊膜混濁；5 級為未累及晶狀體皮質的囊膜混濁；6 級為整個晶狀體成熟致密混濁。晶狀體混濁評分（0～6 分）為相對應的等級，由2 名對分組不知情的熟練實驗操作者進行評價。

1.6 樣本采集

麻醉后引頸處死大鼠，迅速摘除眼球，取出晶狀體，再次評估各組大鼠晶狀體混濁程度，于液氮速凍后放入-80℃冰箱保存備用。

1.7 晶狀體總水溶性蛋白濃度測定

使用玻璃勻漿器處理大鼠晶狀體，根據試劑盒說明書，使用BCA 蛋白檢測試劑盒測定晶狀體總水溶性蛋白濃度，酶標儀測定562 nm處吸光度值。

1.8 ELISA法測定大鼠晶狀體GSH、MDA水平

取冷凍磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶液（PH 7.2）50 mL，稱取晶狀體勻漿，以1∶10 的比例混合，在4℃12,000 rpm 離心15 min。取上清液，使用MDA 試劑盒，ELISA 法測定MDA、GSH含量，所有操作步驟根據試劑盒說明書進行。

1.9 大鼠晶狀體鈣離子濃度測定

晶狀體樣本在100℃加熱12 h 后，測量晶狀體的干重。在室溫下用0.2 mL 的36%濃鹽酸消化晶狀體過夜，加入去離子水至1.0 mL。在12,000 rpm離心12 min 以除去不溶性物質。用分光光度計測定上清液鈣濃度，設置狹縫寬度為0.5 nm，波長為422 nm。使用碳酸鈣和去離子水制備標準溶液，濃度根據相應數值進行換算校正。

1.10 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析，計量資料數據采用均數±標準差（±s）表示，符合正態分布且方差齊的計量資料，方差分析（ANOVA）進行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗。當P＜0.05時，被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芒果苷對大鼠白內障形成的影響

CG 組中所有大鼠的晶狀體均清晰，MG 組所有大鼠均出現中度至重度白內障，分級為4～6級，提示成功建立了亞硒酸鈉白內障大鼠模型；L-MAN組大鼠有輕度到中度白內障，分級為2～4 級；H-MAN 組中10 只大鼠中有8 只大鼠晶狀體透明。4 組間大鼠晶狀體混濁評分比較，差異有統計學意義（F=255.308，P=0.000）。兩兩比較，與CG 組比較，MG 組晶狀體混濁評分升高（t=22.136，P=0.000）；與MG 組比較，L-MAN、H-MAN 大鼠晶狀體混濁評分降低（tL-MAN=4.833，tH-MAN=7.691，均P=0.000），差異均有統計學意義（圖1、表1）。

圖1 芒果苷對白內障形成的影響

2.2 芒果苷對大鼠晶狀體鈣離子濃度的影響

4 組間大鼠晶狀體鈣離子濃度比較，差異有統計學意義（F=187.259，P=0.000）。兩兩比較，與CG組比較，MG 組大鼠晶狀體鈣離子濃度升高（t=22.046，P=0.000）；與MG 組比較，L-MAN、H-MAN組大鼠晶狀體鈣離子濃度降低（tL-MAN=13.706，tH-MAN=16.982，均P=0.000），差異均有統計學意義（表1）。

2.3 芒果苷對大鼠晶狀體總水溶性蛋白的影響

4 組間大鼠晶狀體總水溶性蛋白水平比較，差異有統計學意義（F=47.838，P=0.000）。兩兩比較，與CG 組比較，MG 組的大鼠晶狀體總水溶性蛋白水平降低（t=8.741，P=0.000）；MG 組比較，L-MAN、HMAN 組大鼠晶狀體總水溶性蛋白水平升高（tL-MAN=3.061，P=0.007；tH-MAN=9.742，P=0.000），差異均有統計學意義（表1）。

表1 芒果苷對大鼠晶狀體白內障的影響（±s，n=10）

表1 芒果苷對大鼠晶狀體白內障的影響（±s，n=10）

注：#與CG 組比較，P＜0.05；*與MG 組比較，P＜0.05；CG 對照組；MG 模型組；L-MAN 芒果苷低劑量組；L-MAN 芒果苷高劑量組；MDA 丙二醛；GSH 還原型谷胱甘肽

2.4 芒果苷對大鼠晶狀體氧化應激的影響

4組間大鼠晶狀體MDA、GSH水平比較，差異有統計學意義（FMDA=593.824，FGSH=271.496，均P=0.000）。兩兩比較，與CG組比較，MG組大鼠晶狀體MDA 水平升高（t=31.917，P=0.000），GSH 水平降低（t=27.540，P=0.000）；與MG 組比較，L-MAN、HMAN 組大鼠晶狀體MDA 水平降低（tL-MAN=11.988，tH-MAN=20.427，均P=0.000），GSH 升高（tL-MAN=9.229，tH-MAN=33.772，均P=0.000），差異均有統計學意義（表1）。

3 討論

白內障是一種由各種病因引起的晶狀體混濁，是導致失明的主要原因。亞硒酸鈉白內障模型是模擬年齡相關性核性白內障最常用的動物模型[2-3]。本實驗的結果顯示，向出生9 d 的大鼠一次性皮下注射過量的亞硒酸鈉，在出生第30 d 觀察到MG 組大鼠出現嚴重的雙側核性白內障，而給予芒果苷治療的大鼠白內障程度得到了不同程度的改善。

鈣穩態對晶狀體的維持透明度至關重要[9]。鈣離子-腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）酶被認為在晶狀體鈣穩態中發揮核心作用，使鈣水平保持在亞微摩爾范圍內，而在白內障形成中晶狀體鈣穩態發生了改變[10]。在本研究可以觀察到，CG 組鈣離子含量極低，而MG 組的晶狀體鈣離子含量增高，與上述觀點相符。在使用芒果苷治療組中，大鼠晶狀體中鈣離子水平下降，結合形態學檢查結果，推測芒果苷可能通過降低鈣離子水平，抑制白內障形成。

晶狀體蛋白是保持晶狀體透明的基礎，根據溶解性不同，可分為水溶性、不溶性蛋白，其中水溶性蛋白約占90%。水溶性蛋白分子包括α、β、γ的3種類型，分子結構都含有數目不等的巰基，易被氧化成不溶性蛋白質，形成非均勻介質的增多。晶狀體中水溶性蛋白減少，不溶性晶狀體蛋白增加，使晶體透光性、折射能力受到影響，是白內障發病的物質基礎[11]。本研究結果中，使用強氧化劑亞硒酸鈉，觀察到MG 組的晶狀體總水溶性蛋白減少，結合形態學檢查中觀察到的不溶性蛋白增加，表明結果與前述觀點保持一致。而使用芒果苷治療后，晶狀體總水溶性蛋白增加，推測芒果苷可能通過抑制亞硒酸鈉導致的水溶性蛋白的減少，達到改善白內障的效果。

年齡相關性白內障的形成與自由基相關的氧化應激有關[4]。健康的晶狀體含有GSH，GSH 通過直接清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）來維持蛋白質巰基的主要因子，保護細胞成分免受氧化應激損傷。而老化的晶狀體GSH 減少，抗氧化活性能力下降，ROS 水平升高，過量的自由基作用于脂質發生過氧化反應，氧化終產物為MDA，引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，導致晶狀體混濁，最終形成白內障[12-13]。本研究結果顯示，亞硒酸鈉誘導形成的大鼠白內障晶狀體中，MDA 水平升高，GSH 減少，與SUN Y 等[4]的結果一致，表明白內障的形成與氧化應激相關。研究[7]表明，芒果苷具有抗氧化應激等多種藥理學作用。DING L 等[14]的研究結果證明，芒果苷通過激活骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP2）/Smad核相互作用蛋白（Smad nuclear interacting protein1，SNIP1）信號通路來保護MC3T3-E1細胞免受右旋美托咪啶（dexmedetomidine，Dex）誘導的細胞凋亡和氧化應激。HUANG J 等[15]的研究表明，芒果苷改善了子癇前期小鼠的胎盤氧化應激并激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路。本實驗結果顯示，使用芒果苷治療后，大鼠晶狀體中GSH 水平增加，MDA 水平下降。亞硒酸鈉加速了晶狀體GSH 的消耗，進而增加了晶狀體損傷，表現為是脂質過氧化速率的增加[16]。而芒果苷抑制了由亞硒酸鈉引起的GSH 消耗以及MDA 產生。這些結果表明，芒果苷減少亞硒酸鈉誘導的氧化應激，從而減少晶狀體總水溶性蛋白的氧化，改善白內障的形成。

綜上所述，本研究發現了芒果苷對亞硒酸鈉所致的大鼠白內障具有一定的治療作用，其機制可能是通過維持鈣穩態、抑制亞硒酸鈉導致的氧化應激對水溶性蛋白的氧化，減少不溶性蛋白的生成，從而實現改善大鼠白內障的療效，本研究可為白內障治療提供新思路。