Toll樣受體4信號通路在糖尿病視網膜病變中的研究進展

李曉潔，許澤鵬，黃玉婷，鄭香悅，俞曉藝

糖尿病視網膜病變（diabetes retinopathy，DR）是由糖尿病（diabetes mellitus，DM）引起的最嚴重和最常見的微血管并發癥之一，也是導致工作年齡人群視力下降的主要原因。據統計[1]，目前全球DR患者近9,500萬人，致盲人群中有近1/3是由DR 引起，我國目前DR 在DM 患者中的患病率為30.1%[2]。因此，隨著近年來DM 患者數量劇增，積極探尋DR發病機制及藥物治療研究尤為重要。研究[3]表明，多元醇通路異常、氧化應激、晚期糖基化終末產物增多、蛋白激酶C激活及炎癥反應等多種發病機制均參與到DR 發病。Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）是一種模式識別受體，分布極其廣泛，可以識別外來的致病微生物，調節免疫應答，通過激活細胞內信號轉導通路的方式，產生炎癥反應。本文旨在對TLR4信號通路在DR發病機制中的作用進行綜述。

1 TLR4信號通路

1.1 TLR4結構

Toll 樣受體家族（toll-like receptor，TLR）是自然免疫中的I 型跨膜糖蛋白受體，是特異性免疫和非特異性免疫之間的重要中介。其最早是在果蠅胚胎發育過程中發現，可在果蠅及哺乳動物中廣泛表達[4]。

TLR4 是第一個在哺乳動物身上發現的TLR，分布廣泛，幾乎囊括所有細胞系[5]。TLR4 主要識別外源性配體脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），TLR4 可以發生突變或敲除，使動物對LPS 無反應。TLR4 還可識別某些內源性配體，如游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，OX-LDL）、熱休克蛋白、高速泳動族B1 蛋白（high speed swimming group B1 protein，HMGB1）等，這些內源性配體大部分是在應激和細胞損傷中產生的。TLR4 與其配體結合，經信號轉導可激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），分泌釋放白細胞介素（interleukin，IL）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等細胞因子，這些細胞因子在炎性反應中發揮重要作用[6]。

1.2 TLR4的信號傳導

目前研究[7]表明，TLR4 主要能激活2 種下游信號傳導途徑，一條是髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation protein，MyD88）依賴性信號通路，另一條是MyD88 非依賴性信號通路。

1.2.1 MyD88 依賴性信號通路 MyD88 依賴性信號通路主要是通過NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路發揮作用。在細胞外，LPS和TLR4 結合，使得信號傳導至細胞內，MyD88 被激活，IL-1 受體相關激酶（interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK）磷酸化，與腫瘤壞死因子受體活化因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factors，TRAF-6）相互作用形成IRAK-TRAF6復合物。TRAF6激活NF-κB抑制物激酶（inhibitor of NF-κB kinase，IKK）復合物和轉化生長因子β活化激酶1（transforming growth factor-β activated kinase-1，TAK1），傳導下游的信號通路，最終調控多種細胞因子表達，在細胞增殖、分化、死亡、炎癥等病理過程中發揮作用[8]。

1.2.2 MyD88 非依賴性信號通路 MyD88 非依賴性信號通路主要導致干擾素調節因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）和NF-κB 的延遲激活。β 干擾素TIR 結構域銜接蛋白（TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）被TRIF相關銜接分子（TRIF-related adaptor molecule，TRAM）間接招募，結合TRAF6，一方面激活下游IRF3，使其釋放干擾素γ誘導蛋白10、TNF-α、IL-1等細胞因子，另一方面TRAF6使IKK激活，NF-κB活化釋放至細胞核內，進而調控炎癥因子表達[9-10]。

2 TLR4通路與DM

2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）為多種代謝異常的慢性病癥，其2 大重要病理生理機制是胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島β 細胞分泌不足，而局部組織炎癥是貫穿這兩者的病理特征及中心環節。越來越多的研究[10-13]證實，TLR4 通路可以參與T2DM 及其并發癥的發生發展。

人體內胰島β 細胞分泌胰島素，外周組織胰島素缺陷和敏感性降低導致血糖升高，DM 患者的代謝紊亂引發低度慢性炎癥，進而導致胰腺逐漸喪失胰島β 細胞[14]。TLR4 通路通過調節免疫應答來激活下游炎性信號通路途徑，引起IL-1、IL-6、TNF-α 等細胞因子轉錄。CUCAK H 等[15]研究發現胰島的巨噬細胞中存在大量TLR4 活化，這與細胞因子產生和β 細胞凋亡有密切聯系。WANG X 等[16]發現小鼠TLR4 通路的激活以及隨后產生的IL-1β 和TNF-α 參與了急性靜脈高血糖負荷的胰島β細胞功能障礙的發生。

TLR4 通路可誘導胰島素受體底物自身磷酸化，并干擾胰島素信號級聯反應，阻滯底物與胰島素受體結合，最終引發IR[17]。在其TLR4 的信號轉導中，LPS 作為其主要外源性配體，發揮至關重要的作用。GOMES J 等[18]進行系統評價發現，LPS 與IR 密切相關，T2DM 代謝異常導致LPS 吸收增加，血漿LPS 濃度升高。LPS 結合TLR4 激活下游信號途徑后，多種促炎介質的分泌，包括眾所周知能促進IR 的TNF-α 和IL-6，引起的內毒素血癥與肥胖引起的炎癥糾纏在一起[19]。除此之外，TLR4 信號通路對胰島素信號轉導發揮效應還可以通過參與下丘腦炎癥反應實現[20]。隨著科技不斷發展，TLR4信號通路可能成為治療及預防DM的一個新靶點。

3 TLR4通路與DR

現代醫學研究[21]發現，DM 患者在引起視網膜損傷之前，就已經有了一系列的病理生理改變來破壞視功能，而這些改變可能跟氧化應激、炎性因子釋放、VEGF 產生、糖基化終末產物、表觀遺傳學、基因多態性等多方面有關。TLR4作為免疫蛋白家族成員之一，在各個方面都提示著其與DR 之間存在著密不可分的關系。

3.1 氧化應激

氧化應激是由于活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的形成與清除失衡導致的。在高糖環境下，過量的代謝副產物可通過激活多元醇、氨基己糖、蛋白激酶C 和血管緊張素Ⅱ等多條途徑[22-23]，導致ROS 過量生成。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是生成ROS 的主要酶，過多的葡萄糖使NADPH 再生，細胞內抗氧化劑谷胱甘肽（glutathione，GSH）減少，ROS蓄積過量，進而破壞細胞膜和重要的生物分子，如DNA、蛋白質等，導致細胞壞死。氧化應激在DR 發病機制中處于基礎地位，通過抑制DM 患者過強的氧化應激延緩DR的發展，已得到許多研究[24]的支持。

而TLR4 也在DR 氧化應激中扮演著重要的角色。研究[25]證實，TLR4 基因突變小鼠雖然無法阻斷高劑量鏈脲佐菌素后的高血糖，但延緩了疾病的進展，并改變了缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α）在內的多種氧化應激因子水平。MyD88 是所有TLR 的共同信號分子，可介導NF-κB 的下游激活。高血糖激活TLR4 的表達，依賴于MyD88 以及非MyD88 介導的信號傳遞通路，激活NF-κB 活性，這種效應可能是通過蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活NADPH 氧化酶來介導的[26]。ALOMAR SY 等[27]研究結果表明，二甲雙胍作為輔助治療阻礙DR 發展，部分是通過抑制氧化應激誘導的TLR4/NF-κB 通路和抑制谷氨酸興奮性毒性來實現的。

血管內皮細胞是氧化應激的早期靶標，而TLR4 與晚期內皮祖細胞的功能活性有關，TLR4高表達可降低其存活率、遷移能力、黏附能力和體外血管生成能力[28]；高糖環境下培養的人視網膜內皮細胞TLR4表達上調，通過激活TLR4/NFκB 信號通路，誘導內皮細胞壞死[29]。最新的研究[30-31]表示，內皮細胞中TLR4 的缺失對DM 誘導的損傷具有保護作用，牛蒡子苷可通過下調TLR4蛋白表達來抑制高糖誘導的神經節細胞凋亡和氧化損傷。此外，氧化應激還參與視網膜神經節細胞的損傷，視網膜神經節細胞在高糖環境下，TLR4/NFκB 信號通路被激活，通過抑制TLR4可有效減少神經節細胞壞死[7,32]。

OX-LDL 是TLR4 內源性配體之一。有學者[33]利用多因素Logistic 回歸分析證實，OX-LDL 與DR 的存在顯著相關。血管內皮細胞受到ROS 刺激后，存在于血管內皮下的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）氧化生成OX-LDL，而OX-LDL 通過線粒體電子傳遞鏈等途徑又可以進一步誘導細胞產生ROS，引發線粒體功能受損，誘導細胞凋亡的發生，形成惡性循環[34]。因此，TLR4通路參與DR 的發生過程可能也與OX-LDL/ROS這一途徑相關。

3.2 炎性因子釋放

高血糖介導的炎癥反應是DR 的核心。在DR 病程當中，視網膜血管內皮細胞凋亡，血管通透性增加，血-視網膜屏障破壞及微血栓形成都跟炎癥產生有關。NF-κB 作為細胞內重要的炎性核轉錄因子，能夠調控多種細胞因子在DR中表達[35]，如IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF、血管黏附因子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、巨噬細胞炎性蛋白2（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）等。

TLR4 是NF-κB 上游的經典傳導因子之一，在炎癥病理機制中發揮著一定的作用，TLR4/NF-κB 通路和DR 之間的迷霧也漸漸被諸多學者揭開。CHEN H等[26]進行體外試驗找到了這兩者之間相關性的直接證據，高糖能夠誘導視網膜內皮細胞中TLR4 活化，隨之而來的NF-κB 激活，IL-1、IL-8、TNF-α這些炎性因子水平也相繼釋放，視網膜內皮細胞發生損傷及功能的異常，最終導致DR 發生。相關動物實驗研究[29,36-39]也表明，在DM大鼠的視網膜中，TLR4及炎性因子水平均升高，能夠使得視網膜中的白細胞及血管滲漏量增加，繼而發生血管內皮損傷、視網膜屏障破壞及新生血管（neovascularization，NV）形成等一系列DR 病理改變，而TLR4的敲除可改善DR，同時使視網膜組織厚度增加[40]。

無論體內還是體外實驗，都帶來了極大的啟示，TLR4作為眾多信號通路中的上游級聯分子，可能通過炎性因子的釋放最終直接及間接地參與到DR 的發病之中。有文獻[7,36]報道，利用TLR4 特異性拮抗劑或沉默相關基因可以誘導NFκB 通路失活，抑制細胞的炎癥、凋亡，這充分提示TLR4抑制將成為DR 治療過程當中一個新的治療靶點。隨著研究的進一步開展，許多學者開始運用一些含有抗炎分子的提取物做了相關的研究，這些抗炎物質可以有效地抑制DM 大鼠視網膜TLR4/NF-κB通路活性，改善DR[41-44]。雖然抑制NF-κB介導的炎癥通路可以減少DR 相關的炎癥因子表達，但NFκB也受到多種上游信號因子的影響，因此TLR4/NF-κB通路在DR中的作用機制還有待進一步研究。

3.3 VEGF

VEGF 是一種具有高特異性的血管生成素，過度分泌可以引起視網膜滲出、出血及水腫，促進內皮細胞增殖及血管滲漏，造成嚴重視力損害。而DM 患者長期代謝紊亂使視網膜缺血缺氧，無疑地使周細胞、膠質細胞、色素上皮細胞等細胞過度分泌VEGF。血管生成是DR 發展的一個重要參數，提示早期病變向晚期進展，抗VEGF 藥物治療可以抑制NV再生，減輕血管滲漏，近年來，已廣泛應用到DR治療當中。

缺血缺氧是DR 病理改變的主要誘發因素之一。徐文芹等[45]發現，氧誘導視網膜病變（oxygen-induced retinopathy，OIR）小鼠模型中，TLR4在視網膜大小膠質細胞內均有表達，小膠質細胞本身能夠分泌VEGF 及一些炎性相關因子，當腹腔內注射TLR4 激動劑LPS 后，視網膜NV 顯著增加，這些細胞因子水平也得到提升。CHEN W 等[46]也做了類似研究，玻璃體腔注射TLR4 特異性拮抗劑TAK-242 可明顯縮小OIR小鼠視網膜的無灌注區面積。因此，視網膜在缺血缺氧狀態下，血管通透性增加，血管滲漏，這可能跟TLR4/VEGF 途徑激活有關，而TLR4 拮抗劑的使用可能會成為一種潛在的治療DR的新思路。

HMGB1 是一種由免疫細胞分泌的核蛋白，是參與視網膜損傷的關鍵介質，在DR 發展中扮演著多重角色，不僅能促炎，近年來還被證明具有促血管生成的作用[47-48]。在缺氧狀態下，視網膜色素上皮細胞釋放HGMB1，而作為一種自分泌或旁分泌因子，通過與其他促血管生長因子的過量產生，最終導致DR 發病過程中的血管生成、纖維化改變和結構破壞[49-50]。不僅如此，在最新的一項研究中，GU C 等[51]通過生物信息學分析構建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，確定早期DR 形成NV 相關的樞紐基因，其中就包括TLR4。以上研究提示，TLR4 信號通路能在血管生成中發揮效應，與調控VEGF 表達密不可分。猜測可能存在更多與HGMB1性質類似的危險因子作用到TLR4，且靶向調控TLR4 信號通路有可能抑制血管內皮損害及NV 生成，延緩DR發生發展。

3.4 糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）

AGEs 受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）是免疫球蛋白家族中的一種跨膜受體，因其主要的激動劑AGEs 在長期暴露于高血糖后形成高級糖化產物而得名[52]。AGEs/RAGE 與大多數DR 的并發癥有關，包括ROS、通透性變化、血管損傷和血管生成變化[53-55]。體外實驗[56]中發現，RAGE 定位于視網膜膠質細胞、Müller 細胞；高糖狀態下，HMGB1會與TLR4和RAGE結合[57-58]，通過NF-κB導致炎癥加重。對增殖性視網膜病變的DM患者的研究[59]表明，疾病的嚴重程度與HMGB1水平的增加有顯著的聯系，這可能與HMGB1 介導了DM 誘導的視網膜周圍細胞[60]和Müller 細胞[61]、視網膜神經節細胞和色素上皮細胞[62]的損傷有關。

1項研究[63]表明，增殖期DR的纖維血管組織中巨噬細胞表達AGEs、TRL4 和IL-1β，IL-1β 通過AGEs 刺激的TRL4 信號活化，誘導單核細胞來源的巨噬細胞和小膠質細胞表達半乳糖凝集素-1（galectin-3,Gal-1）。在鏈脲佐菌素誘導的DM中使用RAGE 融合蛋白，證實了抑制RAGE 可以防止早期DR 常見的毛細血管退化、視網膜蛋白的硝化和觸覺過敏癥[64]。另1 項研究[65]表明，A 類清道夫受體（class A scavenger receptor，SR-A）之所以能拮抗RAGE 的作用，主要是因為SR-A 與HMGB1/TLR4/RAGE 信號通路中的主要激酶—MAPK7 相互作用并抑制其磷酸化，從而抑制TLR4 活化，導致促炎細胞因子的分泌減少，緩解DM 視網膜炎癥反應。可見，TLR4 可能是DR 的潛在治療靶點，通過抑制HMGB1/TLR4/RAGE通路可能對DR起到一定的治療作用。

3.5 表觀遺傳學

表觀遺傳學是指在基因核苷酸序列不變的情況下，基因表達可以發生可遺傳性的變化。近年來，表觀遺傳修飾的機制與DR 之間的聯系日益成為新興的1 個研究領域，目前研究較多的包括DNA 甲基化，組蛋白乙酰化以及非編碼RNA干擾等[66]。

基因啟動子持續高甲基化狀態會抑制轉錄因子與DNA結合，導致該基因沉默，基因轉錄活性受到抑制。LIU X等[67]研究表明，隨著DR 病情進展，甲基化水平呈現上升趨勢，葉酸通過調節DNA 甲基化和羥甲基化代謝對DR 視網膜微血管起到緩解作用，這表明外周血液中的DNA 甲基化可以作為DR 疾病進展中的預測性指標。TLR4 與DNA 甲基化之間的關系鮮有人研究，DR 領域更是未見一例。徐慧超等[68]證實，在非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型當中，可以通過調控TLR4 甲基化水平從而下調TLR4 mRNA 表達，抑制炎癥發展。炎癥形成也是DR重要病理過程之一，DR模型中會不會有相同的結果還有待該領域的進一步研究證實。

沉默信息調節因子1（silence information regulation factor 1,SIRT1）是一種NAD+依賴性組蛋白去乙酰化酶，可以參與調節細胞增殖凋亡、炎癥反應、氧化應激等機體生理病理過程。MISHRA M 等[69]研究發現，可以通過SIRT1 過表達從而抑制視網膜血管內氧化應激，防止線粒體損傷，延緩DR 發展。近期亦有學者[42,70]將研究焦點擴展到免疫相關蛋白上，證實SIRT1是高糖狀態下視網膜血管內皮細胞中TLR4通路調節劑，SIRT1 可以直接靶向作用于TLR4 通路，調控ROS 水平，保護細胞免受氧化應激損傷。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）也在DR 表觀遺傳機制中充當重要角色，其可以通過調控下游靶基因（如常見的NF-κB、VEGF 等）的表達來參與DR 發病。目前現代醫學研究中與DR 相關的miRNA 數量不斷增多，但尚未有文獻證實，這些miRNA 是通過靶向作用于TLR4 通路在DR 中發揮調控作用。但在其他醫學領域研究頗豐，例如動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）。AS 屬于大血管病變，與DR同為DM 并發癥，兩者的發生發展都受到DM 這一“共同土壤”的滋養，在發病機制方面存在著不少共性[71]。在AS 模型中，相繼有研究[72-74]顯示，miR-182、miR-204、miR-135可以通過靶向TLR4 抑制OX-LDL 引發的氧化應激和凋亡，改善AS，而已有研究[75]證實，上述miRNA 與DR 有密切聯系。

表觀遺傳修飾、視網膜線粒體穩態及氧化應激三者相輔相成、相互影響，雖然其在TLR4 通路及DR 中的作用機制仍處于早期鉆研階段，但目前現代醫學已有的研究，將為表觀遺傳修飾靶向途徑診治和預防DR提供更多的方向。

3.6 基因多態性

基因多態性是指在1 個生物群體中，同時存在2 種或2 種以上不連續的變異型或等位基因，發生區域一般在基因序列中不編碼蛋白或沒有重要調節功能的區域。生物群體基因多態性現象十分普遍，單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）是最為常見的基因多態性，是指單個堿基通過缺失、插入或替換1 個單核苷酸而發生突變產生的多態性，其中最少1 種等位基因在群體中出現的頻率不小于1%。隨著技術手段的進步，遺傳因素在DR的發生及進程中的重要作用也逐漸為人們所認識，多種與DR 相關的易感基因逐漸被證實[76-77]。

TLR4基因位于第9號染色體的q32～q33片段上。大量研究[78-79]發現，多種疾病的易患性以及預后，與TLR4 基因多態性呈一定的相關性。在1 項研究[80]通過多因素Logistic 回歸分析顯示，TLR4 基因Asp299Gly 的G 等位基因是早發DR的獨立危險因素。TLR-4 基因Asp299Gly、Thr399Ile 變異的次要等位基因的存在是T2DM 的保護因素，能延緩高血糖對微小血管的持續性炎癥損傷[81]。Asp299Gly 可能與DR 易感性有關，而與DM 無關[82]。猜測TLR4 基因Asp299Gly 的G 等位基因可能是視網膜病變風險增加的預測因子，并通過激活相關炎性通路參與DR的發生發展。

4 小結

TLR4 信號通路在DR 的發生和發展過程中扮演中重要角色，且通過對其調控可有效控制炎癥，抑制NV 產生。已有眾多學者在動物模型中通過靶向調控TLR4通路進行治療性研究，但目前所揭示的仍然是TLR4 信號通路在DR 發病機制中的冰山一角。相信進一步研究TLR4 信號通路在DR中的作用及原理，可以為DR 的防治、新藥開發及其他醫學領域的科學研究帶來新的思路和突破。