基于干旱環(huán)境中大鼠淚腺差異表達(dá)蛋白的篩選初探“燥傷清竅”機(jī)理

郝冉，崔阿圓，王麗鑫，張旺旺，史紅

中國西北偏西地區(qū)常年降水量少，相對濕度偏低，植被稀疏，沙漠廣布，干旱、半干旱是其主要的自然特征。有中醫(yī)學(xué)者[1]將此自然特征總結(jié)為“燥氣偏盛，燥發(fā)無時，非獨秋有”，并指出此燥（干旱、半干旱）不同于“因時而至”之秋燥（四季中秋季相對濕度偏低）。當(dāng)防護(hù)不當(dāng)或稟性不耐時，干旱、半干旱區(qū)特有的氣候環(huán)境因素可導(dǎo)致人體罹患“西北燥證”，即以口鼻、眼睛、咽喉、肌膚干燥、干咳、煩躁等不適癥狀為特征的一組中醫(yī)綜合證候，因其發(fā)生于西北地區(qū)，且以干燥癥狀為主，故稱之為“西北燥證”[2]。本研究前期以整體觀念為指導(dǎo)，在探索“燥邪傷肺”微觀機(jī)制之時，不僅觀察到鼻黏膜、氣道和肺組織的病理變化[3]，還觀察到干旱環(huán)境中健康大鼠淚腺腺泡的萎縮融合，腺體組織中β-防御素-2（β-defensins-2）的表達(dá)發(fā)生異常變化[4]。為此，本文通過初步篩選和分析淚腺中的差異表達(dá)蛋白（以下簡稱差異蛋白），以期找到“燥傷清竅”分子機(jī)制的候選靶標(biāo)，為今后從急性眼表損傷相關(guān)指標(biāo)（包括結(jié)膜杯狀細(xì)胞和瞼板腺功能等）出發(fā)探索“燥傷清竅”的機(jī)理提供有價值的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周齡SPF級雌性SD大鼠20只，體質(zhì)量140～160 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心[許可證號為SCXK（新）2018-0002]。本研究實驗動物及條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會的《實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：IACUC-20150225-102）。

1.2 試劑與儀器

二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)有限公司，P0011），串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（tandem mass tag，TMT）試劑盒、乙腈（美國Thermo Fisher Scientific 公司，WD330302、F22M6E20 1），三氟乙酸、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素（美國Sigma-Aldrich公司，BCCD4553、WXBC8963V、SLCD4701、WXBD4821V），胰酶（美國Promega 公司，SRT220102），甲酸（美國Fluka公司，0172192381）。

改造后的程控智能人工氣候箱（上海德洋意邦儀器有限公司，PRX-1250B），砂塵試驗箱（常州市金壇博科實驗設(shè)備研究所，DSC-1000），蛋白電泳儀（上海天能科技有限公司，EPS-300），高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，1260），1200 納升級液相色譜儀、質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司，EasynLC 1200、Q Exactive HF-X）。

1.3 實驗室模擬干旱環(huán)境

基于氣象數(shù)據(jù)分析結(jié)果[5]，項目組建立了實驗室人工模擬干旱環(huán)境的具體方案[6]，并在前期動物實驗研究[3-4]中證實方案可行。具體模擬方法是人工氣候箱按時段設(shè)置溫度，每個時段為2 h，每日共12 個時段，代表子時（23:00～次日0:59）～亥時（21:00～22:59）。

在動物實驗的第1～6 d和第25～30 d 溫度范圍為6～24 ℃，在第7～12 d 和第31～36 d 溫度范圍為16～34 ℃，在第13～18 d和第37～42 d溫度范圍為10～30 ℃，在第19～24 d 和第43～48 d 溫度范圍為-8～6 ℃，日均溫差不低于18 ℃；設(shè)定相對濕度5%～45%，日均相對濕度為（24.33±11.29）%，風(fēng)速3 m/s，光照強(qiáng)度5～20 LUX，遞增或遞減日照總時數(shù)以模擬春夏和秋冬的日照特點（表1）。設(shè)置砂塵試驗箱風(fēng)速6～8 m/s，浮塵（粒徑＜10 μm，300 g/m3/次），吹塵時長20 min/次，2次吹塵間隔10 min，干預(yù)強(qiáng)度1 h/d。

表1 人工氣候箱模擬干旱風(fēng)沙環(huán)境時溫度、濕度與光照度的設(shè)定

1.4 分組與處理

采用隨機(jī)數(shù)字表法，按照體質(zhì)量將20只雌鼠分為2 組，其中對照組（control group，CG）飼喂在常溫（20.5～21.5 ℃）常濕（相對濕度50%～55%）環(huán)境；干旱風(fēng)沙組（dryness &sand dust group，DD）飼養(yǎng)在人工氣候箱和砂塵試驗箱模擬的干旱風(fēng)沙環(huán)境中48 d（即人工燥邪的1 個氣候周期），實驗結(jié)束后大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后腹主動脈采血，摘取大鼠左側(cè)淚腺組織，使用0.9%氯化鈉注射液清洗3 遍，裝于凍存管中，迅速放入液氮后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.5 測試分析

提取淚腺組織蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。胰酶將蛋白酶分解成肽段，TMT 標(biāo)記肽段。高效液相色譜法對標(biāo)記的肽段分級。EASY-nLC 1200超高效液相系統(tǒng)流動相A（0.1%甲酸和2%乙腈水溶液）和流動相B（0.1%甲酸和90%乙腈水溶液）對分級后的肽段分離，分離后的肽段被注入電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）中進(jìn)行電離，Q Exactive HF-X 質(zhì)譜進(jìn)行分析。高分辨的軌道離子阱（Orbitrap）檢測和分析肽段母離子及其二級碎片。用數(shù)據(jù)依賴型掃描（data-dependent acquisition，DDA）程序采集數(shù)據(jù)。Maxquant（v1.5.2.8）檢索二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.6 差異蛋白的篩選和統(tǒng)計學(xué)方法

每個樣本重復(fù)3 次全蛋白定量測試，分別采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、相對標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）和Pearson 相關(guān)性分析評估蛋白定量重復(fù)性。計算出每個樣本在多次全蛋白定量重復(fù)實驗中定量值的平均值，再計算2個樣本之間平均值的比值，該比值是比較組最終的差異表達(dá)量（即相對定量）。將各樣本中某蛋白的相對定量值進(jìn)行l(wèi)og2 對數(shù)轉(zhuǎn)換，以使數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，用組間雙尾t檢驗的方法計算P值。當(dāng)P＜0.05 時，以差異倍數(shù)≥1.2 作為顯著上調(diào)的變化閾值，差異倍數(shù)＜1/1.2 作為顯著下調(diào)的變化閾值。

1.7 差異蛋白的生物信息分析

UniProt-GOA 和InterProScan數(shù)據(jù)庫對鑒定出的差異蛋白進(jìn)行基因本論（gene ontology，GO）分析，從細(xì)胞組成、分子功能及生物過程3個方面對差異蛋白進(jìn)行GO 功能注釋和富集。京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進(jìn)行通路富集分析：使用KEGG在線服務(wù)工具（KEGG Automatic Annotation Server，KAAS）對差異蛋白進(jìn)行注釋后，通過KEGG mapper將注釋后的蛋白與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的通路匹配。

2 結(jié)果

2.1 DD組大鼠淚腺中的差異蛋白

經(jīng)技術(shù)重復(fù)后樣本的蛋白定量結(jié)果符合統(tǒng)計學(xué)上的一致性。篩選出DD組差異蛋白共計505個，表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的蛋白分別有210 個和295 個（圖1）。本研究DD 組淚腺中的部分差異蛋白如表所示（表2）。

表2 干旱風(fēng)沙組大鼠淚腺中的差異蛋白

圖1 干旱風(fēng)沙組大鼠淚腺中的差異蛋白定量重復(fù)性檢驗的統(tǒng)計圖

2.2 DD組大鼠淚腺中差異蛋白GO功能注釋結(jié)果

DD 組大鼠淚腺中上調(diào)和下調(diào)差異蛋白數(shù)位居前2 位的生物進(jìn)程均是細(xì)胞過程和單生物過程，其主要上調(diào)差異蛋白是S100 鈣結(jié)合蛋白A9（S100 calbindin A9，S100A9）和免疫球蛋白γ-2A 鏈C 區(qū)（Ig gamma-2A chain C region,IgG2a）。上調(diào)和下調(diào)蛋白數(shù)位居前2 位的細(xì)胞組成是細(xì)胞和細(xì)胞器，主要上調(diào)差異蛋白均有S100A9。此外，細(xì)胞中還有IgG2a，細(xì)胞器中有三磷腺苷合酶抑制因子1。上調(diào)和下調(diào)蛋白數(shù)位居前2位的分子功能是結(jié)合和催化活性，其中結(jié)合功能中主要上調(diào)差異蛋白是S100A9和免疫球蛋白γ-2A鏈C區(qū)，催化活性功能中主要上調(diào)差異蛋白有E3 泛素蛋白連接酶和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）（圖2）。

圖2 差異蛋白GO二級分類統(tǒng)計圖

2.3 DD組大鼠淚腺中差異蛋白GO功能富集結(jié)果

DD 組大鼠淚腺中上調(diào)差異蛋白在生物進(jìn)程方面主要富集在其他生物體的防御反應(yīng)（IgG2a）、質(zhì)膜內(nèi)陷（IgG2a）、對細(xì)菌的防御反應(yīng)、吞噬作用（IgG2a）和B 細(xì)胞介導(dǎo)免疫（IgG2a）。在分子功能方面則是免疫球蛋白受體結(jié)合和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶活性。在細(xì)胞組成方面為細(xì)胞外間隙、循環(huán)免疫球蛋白復(fù)合物和免疫球蛋白復(fù)合物。在生物進(jìn)程方面下調(diào)差異表達(dá)蛋白主要富集在橫紋肌收縮、氫傳輸、膠原原纖維組織和單價無機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運。分子功能方面則富集在肌動蛋白絲結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分和肌動蛋白結(jié)合方面。細(xì)胞組成方面富集在收縮纖維、收縮纖維部分、橫紋肌細(xì)絲和肌絲方面（圖3）。

圖3 差異蛋白GO功能富集

2.4 DD 組大鼠淚腺中差異蛋白的KEGG 通路富集結(jié)果

DD 組大鼠淚腺中上調(diào)差異蛋白主要富集在抗原加工呈遞、哮喘等相關(guān)通路（圖4A、圖5）；下調(diào)差異蛋白主要富集在氧化磷酸化、帕金森病、蛋白質(zhì)消化和吸收等通路（圖4B）。

圖4 差異蛋白的KEGG通路富集

圖5 上調(diào)差異蛋白富集的主要信號通路

3 討論

《素問·陰陽應(yīng)象大論》[7]曰：“燥勝則干”，指出燥邪易傷津液，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)干澀、堅斂之變。燥易傷肺，肺失宣肅，清竅失養(yǎng)則可癥見目、口鼻、咽喉干燥，干咳，大便干燥，小便短赤等“外燥”之象。干旱、半干旱區(qū)“燥氣偏盛”，防護(hù)不當(dāng)或體質(zhì)異稟時，特有的環(huán)境因素可作為危險因素導(dǎo)致機(jī)體處于亞健康狀態(tài)[2]，抑或誘發(fā)疾病的發(fā)生。如趙孝國等[8]的研究證實，干旱風(fēng)沙環(huán)境作為誘因可致口舌、目鼻、咽喉等暴露性器官“干澀”不適，甚則病發(fā)急慢性結(jié)膜炎等。周銘心等[2]將“眼干”“眼癢”“目眵多”等眼部癥狀作為辨識西北燥證主證（又稱肺衛(wèi)孔竅皮膚燥證）的主要依據(jù)之一，故本文從“外燥”影響“眼部外候”探索“燥傷清竅”的機(jī)理。

淚膜覆蓋于眼前表面，從表到里依次為脂質(zhì)層、水液層（由淚腺和副淚腺分泌）、黏液層，是眼表的保護(hù)層，其穩(wěn)態(tài)與眼表健康密切相關(guān)[9]。淚液屬人體津液[10]，也是淚膜的重要組分。結(jié)合干旱環(huán)境中健康大鼠外周血CD4+/CD8+值異常升高[11]，淚腺腺體萎縮[4]等研究結(jié)果，本研究著眼于炎癥反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)和細(xì)胞凋分析差異蛋白，并初步選定探索外燥證“燥傷清竅”機(jī)制的候選靶標(biāo)。

S100A9 常與S100 鈣結(jié)合蛋白A8 形成異源二聚體，激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[12]，也能刺激白細(xì)胞募集和細(xì)胞因子分泌而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。α-1-酸性糖蛋白（alpha-1-acid glycoprotein，AGP1）在炎癥或感染時，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1和白細(xì)胞介素-6 參與免疫調(diào)節(jié)。S100A9 和AGP1 均被證實為干眼淚液中的生物標(biāo)志物[13]，故S100A9 和AGP1 是較為理想的眼表炎癥反應(yīng)相關(guān)的候選靶標(biāo)。

其次，趨化因子C-X3-C 基元配體1（chemokine C-X3-C motif ligand 1，CX3CL1）可誘導(dǎo)白細(xì)胞黏附與遷徙，趨化B 細(xì)胞和T 細(xì)胞，調(diào)控炎癥進(jìn)程并引發(fā)免疫損傷，其表達(dá)與干眼癥狀的嚴(yán)重程度正相關(guān)[14]。而存在于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的MPO 則可利用過氧化氫形成具有氧化能力的自由基，進(jìn)而參與機(jī)體的氧化應(yīng)激[15]，導(dǎo)致眼表組織損傷。下調(diào)蛋白泛醇-細(xì)胞色素C 還原酶鉸鏈蛋白（ubiquinolcytochrome c reductase hinge protein，UQCRH）則能通過減少氧化損傷調(diào)節(jié)線粒體功能，從而對抗慢性疾病中的氧化應(yīng)激反應(yīng)[16]。在本研究中UQCRH 表達(dá)水平降低，UQCRH 抗氧化損傷的功能減弱，可能會減輕對抗眼表的氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，從而產(chǎn)生干眼癥狀。MPO 和UQCRH 均參與機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激反應(yīng)對眼表上皮有直接的促炎作用，能引發(fā)二次免疫反應(yīng)，從而加劇眼表損傷[17]。因此，CX3CL1、MPO 和UQCRH 蛋白也可作為眼表炎癥反應(yīng)相關(guān)的候選靶標(biāo)。

T-激肽原1（T-kininogen 1，KNT1）在激肽釋放酶作用下可以生成激肽，激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)所有成分都存在于眼中并參與調(diào)節(jié)眼部血流量，炎癥急性期時KNT1 表達(dá)增加表達(dá)增加。蛋白酶體亞基β-8（proteasome subunit β type-8，PSMB8）為免疫蛋白酶體，是炎癥反應(yīng)的重要成分和調(diào)節(jié)劑，在內(nèi)源性抗原加工呈遞中起關(guān)鍵作用，抗原加工呈遞對適應(yīng)性免疫至關(guān)重要。下調(diào)蛋白血清轉(zhuǎn)鐵蛋白（serotransferrin，TF）在細(xì)胞內(nèi)外鐵離子代謝平衡中發(fā)揮重要作用，具有抗微生物的功能，與細(xì)胞的生長分化和細(xì)胞保護(hù)功能有關(guān)，是眼表天然的免疫系統(tǒng)。TF在干眼初期水平降低，其對眼表的保護(hù)作用減弱，同時導(dǎo)致淚液中鐵離子失平衡而損傷細(xì)胞[18]，因此TF 的下調(diào)提示DD 組大鼠可能出現(xiàn)干眼癥狀。故KNT1、PSMB8、TF 可作為眼表炎癥反應(yīng)相關(guān)的候選靶標(biāo)。

差異蛋白前列腺素D 合酶（prostaglandin D synthase，PGDS）可催化前列腺素H2（prostaglandin H2，PGH2）使其轉(zhuǎn)化為前列腺素D2（prostaglandin D2，PGD2），后者是誘導(dǎo)過敏反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。IgG2a 是免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的一個亞型，與IgG Fc 段受體（Fc gamma R，F(xiàn)cγR）結(jié)合可誘導(dǎo)全身性過敏反應(yīng)。研究[2]證實，罹患西北燥證（尤指肺衛(wèi)孔竅皮膚燥證）者過敏性鼻炎發(fā)病率高于未罹患西北燥證者。過敏性鼻炎表現(xiàn)為鼻癢、噴嚏、鼻分泌亢進(jìn)、鼻黏膜腫脹等癥狀，常伴眼癢或眼干，故推測PGDS和IgG可作為與眼表過敏反應(yīng)相關(guān)的主要候選靶標(biāo)。

差異蛋白熱休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）、酪蛋白激酶Ⅱα'亞基（casein kinase 2 alpha 2，CSNK2A2）、泛素羧基末端水解酶L3（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L3，UCHL3）和S100A9均是與眼表細(xì)胞凋亡相關(guān)的候選靶標(biāo)。HSP27為在應(yīng)激反應(yīng)中被高度誘導(dǎo)的蛋白之一，可通過與含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）和細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cytc）結(jié)合，使Caspase級聯(lián)失活，從而阻止細(xì)胞凋亡，HSP27 的上調(diào)提示淚腺細(xì)胞凋亡可能存在異常增強(qiáng)的趨勢。下調(diào)蛋白CSNK2A2是酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinase II，CK2）的催化亞基，可磷酸化多種底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)錄等細(xì)胞過程。CSNK2A2 能促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡。CSNK2A2 在許多腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[19]。下調(diào)蛋白UCHL3 屬于去泛素化酶（deubiquitinases，DUBs）中泛素羧基末端水解酶（ubiquitin terminal hydrolase，UCHs）家族，從蛋白質(zhì)底物中去除泛素，保護(hù)蛋白質(zhì)免于降解，并且釋放游離泛素參與循環(huán)泛素化反應(yīng)，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞過程，例如細(xì)胞生長、分化、發(fā)育和凋亡等。泛素化是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的途徑，許多凋亡因子通過泛素化調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。有研究[20]表明，UCHL3水平降低導(dǎo)致細(xì)胞中的促凋亡因子P53 蛋白、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)X 蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、Caspase-3 增加，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在本研究中，CSNK2A2 和UCHL3 呈低表達(dá)，可以促進(jìn)淚腺細(xì)胞凋亡，與DD 組大鼠淚腺組織病理表現(xiàn)淚腺細(xì)胞萎縮相印證。此外，S100A8/S100A9 可改變促凋亡和抗凋亡蛋白間的平衡誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。故HSP27、S100A9、CSNK2A2 和UCHL3 和可以作為淚腺凋亡的候選靶標(biāo)。

綜上所述，S100A9、AGP1、CX3CL1、MPO、UQCRH、KNT1、PSMB8、PGDS、IgG、HSP27、TF、CSNK2A2 和UCHL3 等候選靶標(biāo)的驗證結(jié)果可用于從炎癥反應(yīng)、過敏反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的角度，選擇有價值的信號通路從眼部癥狀探索“燥傷清竅”的機(jī)理。此外，本研究基于蛋白表達(dá)對“燥傷清竅”的機(jī)制進(jìn)行了初步探索，目的在于挖掘燥邪損傷機(jī)體的微觀機(jī)制，故目前研究尚未涉及動物模型的建立與評價，也未能就燥邪干預(yù)下眼表急性損傷機(jī)制、共患疾病對眼表微環(huán)境中炎性因子或凋亡因子水平，及雌激素水平與淚腺分泌及蛋白表達(dá)的相關(guān)性等進(jìn)行更深入研究，故所獲研究結(jié)論僅具導(dǎo)向性價值。