水黃皮中水黃皮素的提取及其對桔小實蠅的殺蟲活性

任軍華，趙永亮，王 輝，李玖慧，趙春杰，盧紹鵬，熊 焰，伍蘇然

水黃皮中水黃皮素的提取及其對桔小實蠅的殺蟲活性

任軍華1，趙永亮1，王 輝2，李玖慧2，趙春杰1，盧紹鵬2，熊 焰2，伍蘇然2*

1. 河南工業大學生物工程學院，河南鄭州 450046；2. 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南海口 571101

桔小實蠅是一種毀滅性害蟲，可為害200多種水果，目前其防治方法或毒性大，對環境不友好，或成本高昂。本研究擬采用廉價易得的水黃皮莢果為原料，采用超聲波輔助提取法，單因素試驗比較乙醇濃度，乙酸乙酯、石油醚、正己烷和乙醇的料液比對水黃皮莢果中水黃皮素提取率的影響，得出最優溶劑及其料液比；再分別采用浸漬法和葉碟法測定其提取物對桔小實蠅的卵孵化抑制活性和對1齡幼蟲的胃毒活性。結果表明，乙醇最佳提取濃度為60%，乙酸乙酯、石油醚、正己烷與60%乙醇的最佳料液比分別為1∶30、1∶20、1∶30和1∶25，提取率分別為0.48%、0.31%、0.37%和0.44%，即1∶30乙酸乙酯的提取效果最好。殺蟲活性研究表明，2%水黃皮提取物對桔小實蠅的卵孵化抑制作用最強，校正孵化抑制率為58.53%，6%提取物對卵孵化抑制作用次之，校正孵化抑制率為46.46%；4%提取物對桔小實蠅1齡幼蟲胃毒活性最好，24 h校正死亡率為54.05%，48 h校正死亡率為95.94%。以乙酸乙酯為溶劑，料液比1∶30時，水黃皮中水黃皮素的提取效果最好，其提取率是0.48%。水黃皮提取物對桔小實蠅的卵孵化有抑制作用，對1齡幼蟲有胃毒活性，因此有望開發為針對桔小實蠅的植物源殺蟲劑。

水黃皮；水黃皮素；提取；桔小實蠅；卵孵化抑制活性；胃毒活性

桔小實蠅（）又名東方果實蠅，俗稱果蛆，可為害芒果、柑橘、蘋果、楊桃等200多種水果，是一種毀滅性害蟲。雌蟲將卵產于果實內，孵化為幼蟲蛀食為害，造成果實表面凹凸不平，果汁外溢，嚴重為害時造成果實腐爛、落果甚至絕收[1]。桔小實蠅食性雜、寄主范圍廣，繁殖能力強、世代重疊嚴重、遷飛能力強[2]，防治困難。目前田間桔小實蠅防治主要有化學防治、物理防治、誘劑誘捕防治和生物防治[3]。化學防治在田間可有效防治桔小實蠅成蟲，但對人畜毒性大，易產生抗藥性[4-5]，且對環境不友好；物理防治法，如粘蟲板法和果實套袋法主要針對其成蟲[6]，應用黃色和綠色實蠅粘蟲板可誘捕小范圍種植果蔬大棚中的桔小實蠅成蟲[7]，在幼果期套袋可有效防治桔小實蠅成蟲在果實上產卵[3]，但上述方法操作復雜，作用范圍有限且人力成本高[8-9]。誘劑誘捕防治方法也稱引誘法，主要包括類性信息素（甲基丁香酚）引誘和食物（醋酸銨+腐胺+三甲胺復合制劑3C）引誘，前者僅能引誘雄蟲，防治效果有限，且對人體有害，后者引誘桔小實蠅雌蟲比例較高，但引誘效果有限[10-11]。生物防治法主要是針對桔小實蠅幼蟲和卵，如利用桔小實蠅天敵寄生蜂[12]或病原菌，如綠僵菌、白僵菌[3]等生物防治方法。寄生蜂主要寄生在桔小實蠅卵和幼蟲中，抑制桔小實蠅卵孵化或幼蟲生長，造成桔小實蠅種群減少[13]。綠僵菌、白僵菌能侵染桔小實蠅的幼蟲、蛹和成蟲[14-16]，使其發病而達到防治目的，但防治效果有限[11]。故尋找綠色、高效、價格低廉的防治方法迫在眉睫。

水黃皮[(L.) Merr.]別名水流豆，為豆科水黃皮屬半紅樹植物[17]，是一種熱帶亞熱帶植物，廣泛分布于澳大利亞、印度、馬來西亞及我國南部的廣東、廣西、海南和臺灣等省（區）的沿海灘涂地[18]，其分布面積廣，莢果產量大[19]。水黃皮的根、莖、葉、果等均可入藥[20]，在我國和印度民間均有應用。水黃皮提取物因含有大量呋喃黃酮類化合物而具備良好的殺蟲活性，可作為昆蟲生長調節劑、趨避劑、產卵抑制劑和殺蟲劑[21-22]，在印度已開發成農藥[22]。但目前還未見利用水黃皮提取物防治桔小實蠅的相關報道。水黃皮所含的呋喃黃酮中水黃皮素含量最大[23]，所以水黃皮素的提取率直接影響其殺蟲活性。水黃皮素難溶于水，能溶于石油醚、正己烷、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑中，不同溶劑對水黃皮素的溶解度有很大差異，從而導致其提取率的不同。李莉婭等[18]利用乙醇提取得到水黃皮粗提物。趙映淑等[24]利用乙醇加熱回流輔助提取水黃皮素，得出60%乙醇80℃回流提取3次，每次1.0 h提取效果最好。其他溶劑對水黃皮素的提取工藝鮮有報道。故在前人的研究基礎上，本研究利用超聲波輔助提取法探索提取水黃皮中水黃皮素的最佳溶劑和料液比，并研究其提取物對桔小實蠅的卵孵化抑制活性和對幼蟲的胃毒活性，為開發安全、高效的植物源農藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

水黃皮莢果采自海南省海口市萬綠園，90℃烘干、粉碎、過40目篩，細粉干燥保存，備用。水黃皮素（純度99.24%）購自上海陶素生化科技有限公司；95%乙醇、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、甲醇購自佛山西隴化工有限公司，均為分析純；乙腈購自美國TEDIA公司，為色譜純；自制純化水；桔小實蠅（）采自海南省海口市楊桃園，建立室內種群。

主要儀器設備：2695-2489高效液相色譜儀（Waters），ZF-C20002電子天平（深圳飛亞衡器公司，Max2000g，感量0.01 g），PTX-F A20S電子天平（華志電子科技有限公司，感量0.0001 g）；SB-1100旋轉蒸發儀（EYELA），DKN812C電熱恒溫箱（深圳市精度環越科技有限公司），FDU-2110冷凍干燥機（上海愛朗儀器有限公司），PL-S80T數顯超聲波清洗機（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝分析方法 （1）對照品溶液制備。精密稱取水黃皮素對照品1.36 mg于10 mL量瓶中，用甲醇定容至10 mL，即得每1 mL溶液含0.136 mg水黃皮素對照品。

（2）色譜條件。色譜柱Unitary-C18ODS2（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；流動相：水-乙腈（梯度洗脫）；流速1 mL/min；檢測波長258 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL。洗脫程序見表1。

表1 水黃皮素流動相梯度洗脫程序

（3）水黃皮素提取率的測定。采用高效液相色譜法測定水黃皮素含量，將上述處理溶液配制的0.136 mg/mL水黃皮素標準溶液，通過甲醇梯度稀釋配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的水黃皮素標準對照品溶液，以無水乙醇溶液作空白對照，在最大吸收波長258 nm下測定吸光度，以提取液濃度（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，曲線回歸方程=6.81438×107-487195.2（= 0.9996）。

按以下公式計算水黃皮素提取率：

式中，為稀釋后水黃皮素濃度，mg/mL；為水黃皮素提取液體積，mL；為稀釋倍數；為樣品質量，mg。

1.2.2 水黃皮中水黃皮素的提取 采用超聲波輔助提取法。稱取水黃皮粉末2.00 g，置于50 mL窄口三角瓶中，加入不同的溶劑（乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚）浸泡30 min，室溫下超聲輔助提取10 min，靜置10 min，超聲輔助提取10 min，依此循環3次，2000 r/min離心，取上清液，用甲醇定容于50 mL容量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾。使用高效液相色譜法（HPLC）分析，代入上述公式計算提取率。

1.2.3 單因素試驗 （1）乙醇濃度對水黃皮素提取率的影響。采用超聲波輔助提取法，在料液比1∶20（g/mL）的條件下，考察乙醇不同濃度（40%、60%、80%、95%）對水黃皮中水黃皮素提取率的影響。

（2）溶劑料液比對水黃皮素提取率的影響。采用超聲波輔助提取法，考察不同料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）的60%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷對水黃皮中水黃皮素提取率的影響。

（3）不同溶劑最佳料液比對水黃皮素提取率的影響。采用超聲波輔助提取法，考察60%乙醇（1∶25）、石油醚（1∶20）、乙酸乙酯（1∶30）、正己烷（1∶25）對水黃皮中水黃皮素提取率的影響。

1.2.4 殺蟲活性試驗 （1）水黃皮提取物的制備。稱取水黃皮莢果粉500 g，加入1500 mL乙酸乙酯浸泡30 min，超聲輔助提取30 min，過濾，濾渣反復提取直至提取液不變色，過濾，合并濾液，減壓濃縮至浸膏，真空冷凍干燥24 h，得干燥的提取物浸膏，HPLC檢測其水黃皮素含量為4.68%。將浸膏移至干燥器中保存。稱取8 g浸膏，溶于100 mL 95%乙醇，配置成濃度為8%（g/mL）的提取物，取出部分分別稀釋為1%、1.5%、2%、4%、6%的提取物，備用。

（2）水黃皮提取物對桔小實蠅卵的孵化抑制活性測定。將產于同一天的100粒桔小實蠅卵浸入1%水黃皮提取物中10 s，取出，放入裝有飼料的培養皿中。對照組將同樣數量桔小實蠅卵浸入95%乙醇中10 s，放入裝有飼料的培養皿中。5 d后檢查并記錄孵化卵粒數，根據公式計算卵孵化抑制率和校正孵化抑制率。以此方法分別測試1.5%、2%、4%、6%、8%提取物的抑制活性，各處理和對照均重復4次。

孵化抑制率=未孵化卵粒數/供試總卵粒數× 100%

校正孵化抑制率=（處理組卵孵化抑制率-對照組卵孵化抑制率）/（1-對照組卵孵化抑制率）× 100%

（3）水黃皮提取物對桔小實蠅1齡幼蟲的胃毒活性測定。將蘋果切成1～2 mm厚，2 cm×2 cm的薄片，浸入2%水黃皮提取物中10 s，取出，晾干，放入干凈的培養皿中，接入1齡幼蟲30頭。對照組將同樣規格的蘋果片浸入95%乙醇中10 s后，晾干，放入干凈培養皿中，接入1齡幼蟲30頭。24 h后更換同樣處理的蘋果片，記錄存活幼蟲數，根據公式計算死亡率和校正死亡率。以此方法分別測試4%、6%、8%提取物的胃毒活性測定，各處理和對照均重復4次。

死亡率=試蟲死亡數/試蟲總數×100%

校正死亡率=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）×100%

1.3 數據處理

使用Microsoft Excel 97-2003軟件對試驗數據進行統計，利用IBM SPSS Statistics 26軟件進行顯著性檢驗和方差分析。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對水黃皮中水黃皮素提取率的影響

水黃皮素提取率隨乙醇濃度的增大呈先升后降的趨勢，如圖1所示，當乙醇濃度為60%、80%和95%時，其提取率之間無顯著差異，但均顯著大于乙醇濃度為40%的提取率。綜合考慮提取成本，乙醇最佳提取濃度為60%。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.2 60%乙醇料液比對水黃皮中水黃皮素提取率的影響

水黃皮素提取率隨60%乙醇料液比的增大呈逐漸上升的趨勢，如圖2所示，當乙醇料液比為1∶25與1∶30時，其水黃皮素提取率無顯著性差異，但均顯著大于乙醇料液比為1∶15和1∶20的提取率。即乙醇最佳提取料液比為1∶25。

2.3 石油醚料液比對水黃皮中水黃皮素提取率的影響

石油醚料液比對水黃皮素提取率的影響如圖3所示，水黃皮素的提取率隨料液比的增大呈上升趨勢，當料液比為1∶20、1∶25和1∶30時，三者提取率無顯著性差異，但均顯著大于料液比為1∶10和1∶15的提取率。為了降低生產成本，故石油醚最佳提取料液比為1∶20。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.4 乙酸乙酯的料液比對水黃皮中水黃皮素提取率的影響

水黃皮素提取率隨乙酯料液比的增大呈先降后升的趨勢，如圖4所示，乙酸乙酯料液比越高，水黃皮中水黃皮素提取率越佳。乙酸乙酯料液比為1∶30時的提取率顯著高于其他料液比，即乙酸乙酯最佳料液比為1∶30，其提取率為0.46%。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.5 正己烷的料液比對水黃皮中水黃皮素提取率的影響

水黃皮素提取率隨正己烷料液比的增大呈上升趨勢，如圖5所示，正己烷料液比越高，水黃皮素的提取率越高。當料液比為1∶25和1∶30時提取率無顯著性差異，但二者的提取率顯著高于其他料液比，所以正己烷最佳提取料液比是1∶25。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.6 不同溶劑對水黃皮中水黃皮素提取率的影響

不同溶劑對水黃皮素的提取率差異顯著（圖6），其中乙酸乙酯的提取效果最好，水黃皮素的提取率為0.48%，顯著高于其他溶劑的提取率，60%乙醇的提取效果次之，石油醚的提取效果最差。溶劑對化合物的提取率與其對化合物的溶解度有關，即溶解度越高，提取率越高。根據相似相溶原理，化合物在與其極性相似的溶劑中溶解度最高。水黃皮素極性中等，所以中等極性的溶劑如60%乙醇和乙酸乙酯對其溶解度較好，對其提取率也相對較高。乙醇價格低廉，可與水以任意比例互溶，可用于多種有機化合物的提取，但是有些多糖、蛋白質和多肽也溶于乙醇，所以在提取過程中這些雜質也同時被提取出，從而造成濃縮容易起泡，難以濃縮控制條件。乙酸乙酯價格低廉，其提取物中蛋白質和多糖類雜質相對較少，濃縮方便，故水黃皮中水黃皮素的最佳提取溶劑為料液比1∶30的乙酸乙酯。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.7 水黃皮提取物對桔小實蠅卵孵化抑制活性的影響

水黃皮提取物對桔小實蠅卵孵化的抑制活性的影響如圖7所示，不同濃度水黃皮提取物對桔小實蠅的卵孵化具有抑制作用，抑制效果隨提取物濃度的提高呈先升后降的趨勢，當濃度為2%時卵孵化校正抑制率最高，達到58.6%，顯著高于濃度為1%、1.5%、8%時的卵孵化抑制率（方差齊性為0.065>0.05，符合方差齊性；<0.05），與濃度為4%、6%時的校正抑制率無顯著性差異（>0.05）。故2%水黃皮提取物對桔小實蠅卵的孵化抑制活性最強。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.8 水黃皮提取物對桔小實蠅1齡幼蟲胃毒活性的影響

不同濃度的水黃皮提取物對桔小實蠅1齡幼蟲均有胃毒作用（圖8），24 h和48 h幼蟲的校正死亡率隨提取物濃度的增大呈先升后降的趨勢，4%水黃皮提取物對桔小實蠅1齡幼蟲24 h的胃毒活性最強，校正死亡率為54.1%，但與6%、8%提取物對1齡幼蟲24 h的胃毒活性無顯著差異（方差齊性為0.920>0.05，符合方差齊性；>0.05），均顯著高于濃度為2%提取物的胃毒活性（<0.05）；4%水黃皮提取物48 h胃毒活性最強，顯著高于其他濃度的胃毒活性（方差齊性為0.141>0.05，符合方差齊性；<0.05），其校正死亡率高達95.9%。

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

3 討論

水黃皮主要生長于我國沿海灘涂地，分布廣，面積大，其莢果結果量大，單株水黃皮樹可產莢果約7200～19 200個，種子單產可達2250～ 63 000 kg/hm2[19]。水黃皮莢果中具有殺蟲活性的成分是呋喃黃酮類化合物，其中水黃皮素含量最高。本研究為測試不同有機溶劑對水黃皮素的提取率，首先測試了不同乙醇濃度對提取率的影響，再比較同一溶劑不同料液比對提取率的影響，最后比較不同溶劑最優料液比對水黃皮素提取率的影響，結果發現，60%乙醇對水黃皮素的提取率最佳，該結果與趙映淑等[25]的研究結果一致；料液比為1∶30的乙酸乙酯提取效果最好，其提取率為0.48%。趙映淑等[24]測定了水黃皮不同部位的水黃皮素含量，結果顯示根部的水黃皮素平均含量為1.64%，莖部水黃皮素平均含量為2.06%，葉部水黃皮素平均含量為2.18%。本研究中的水黃皮素含量雖遠低于趙映淑等[25]的水黃皮素含量結果。而本研究所采用的材料是水黃皮莢果屬于可再生資源，不會對水黃皮樹木造成損傷或者破壞。

利用植物中提取的活性物質防治害蟲已成為綠色、高效、低毒農藥開發的新趨勢，已報道多種植物中存在具有殺蟲活性的物質[26-27]。目前已篩選出擬除蟲菊酯植物源殺蟲劑對蚜蟲、粉虱等昆蟲的幼蟲有很好的防治效果；迷迭香、薄荷等植物提取物對昆蟲和螨蟲的卵、幼蟲和成蟲具有毒殺作用[21]。本研究以水黃皮莢果提取物為試劑，對桔小實蠅卵孵化具有抑制作用，濃度為2%時卵孵化校正抑制率最高，達到58.6%，這與黃雪峰[28]的研究結果相似，黃雪峰[28]研究表明，5種植物源殺蟲劑對黑腹果蠅卵孵化均具有抑制作用，其中黎蘆堿32 h的校正卵孵化抑制率最高，為91.96%，印楝素32 h的校正卵孵化抑制率最低，為6.19%。本研究還驗證了水黃皮莢果粉提取物對1齡桔小實蠅的胃毒活性，4%水黃皮提取物48 h胃毒活性最強，顯著高于其他濃度的胃毒活性，其校正死亡率高達95.9%。此結果與丁吉同等[29]研究的4種植物源殺蟲劑（魚藤酮、蟲菊·苦參堿、桉油精、氧苦·內酯）對舞毒蛾幼蟲的胃毒作用和黃雪峰[28]研究的5種植物源殺蟲劑（魚藤酮、黎蘆堿、除蟲菊素、苦參堿、印楝素）對黑腹果蠅幼蟲的胃毒活性的結果一致。目前田間防治桔小實蠅的主要方法是果實套袋法，但是套袋前桔小實蠅已在部分果實中產卵，導致果實腐爛、落果，或者采摘后卵在果實中孵化成幼蟲，影響果實銷售。本研究證實了不同濃度水黃皮提取物對桔小實蠅卵孵化的抑制作用及對1齡幼蟲的胃毒活性，有望開發成綠色農藥用于套袋前果實處理。

4 結論

料液比1∶30的乙酸乙酯對水黃皮莢果中水黃皮素的提取效果最好，提取率可達0.48%。水黃皮莢果提取物對桔小實蠅的卵孵化有抑制作用，且對其1齡幼蟲具有很好的胃毒活性。水黃皮提取物對人畜低毒，價廉易得，具有較好的應用前景。

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Extraction of Karanjin fromand Its Insecticidal Activity Against

REN Junhua1, ZHAO Yongliang1, WANG Hui2, LI Jiuhui2, ZHAO Chunjie1, LU Shaopeng2, XIONG Yan2, WU Suran2*

1. College of Bioengineering, Henan University of Technology, Zhengzhou, Henan 450046, China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China

is a destructive pest, which can harm more than 200 fruits. At present, prevention and control measures ofare toxic, environmentally unfriendly, or costly. In this study,pod, which is cheap and easily available, was as the raw material, and ultrasonic-assisted extraction was performed to extract karanjin from its powder. Effect of ethanol concentration, material ratios of ethyl acetate, petroleum ether,-hexane and ethanol on extraction rate of karanjin were compared by single factor experiments to obtain the optimal solvent and material/solvent ratio. Egg hatching inhibition activity of EPP againstand its gastric toxicity on 1st instar larvae ofwas measured by the immersion method and leaf disc method, respectively. The optimal concentration of ethanol was 60%, and the best material-liquid ratios of ethyl acetate, petroleum ether,-hexane and 60% ethanol was 1∶30, 1∶20, 1∶30 and 1∶25, respectively, with the extraction rates 0.48%, 0.31%, 0.37% and 0.44%, respectively, suggesting that the optimal solvent is ethyl acetate with material-liquid ratio 1∶30. The results of insecticidal activity showed that 2% EPP had the strongest egg hatching inhibition activity onwith corrected inhibition rate 58.53%, and 6% EPP the second, with corrected hatching inhibition rate was 46.46%; 4% EPP had the best gastric toxicity against 1st instar larvae ofwith 24 hours corrected mortality 54.05%, and 48 hours corrected mortality 95.94%. Extraction rate of karanjin from the pod powder ofwas the highest when the solvent was ethyl acetate, and solid-liquid ratio was 1∶30, with the extraction rate 0.48%. EPP had an egg hatching inhibition activity againstand gastric toxicity activity on its 1st instar larvae, so it is expected to be developed as a plant-derived pesticide against

; karanjin; extraction;; egg hatching inhibition activity; gastric toxicity

S482.3

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.013

2022-05-19；

2022-07-25

農業農村部農作物病蟲害監測、預警與防治項目（No. 15226039）。

任軍華（1993—），女，碩士研究生，研究方向：昆蟲行為與化學生態學。*通信作者（Corresponding author）：伍蘇然（WU Suran），E-mail：wusuran@163.com。