胡椒PnCAD基因的克隆和表達分析

孫也喬，王 玨，胡麗松，伍寶朵，郝朝運,5，范 睿,5*

胡椒基因的克隆和表達分析

孫也喬1,2,3，王 玨1,2,3，胡麗松2,3，伍寶朵2,4，郝朝運2,4,5，范 睿2,4,5*

1. 海南大學熱帶作物學院，海南海口 570228；2. 中國熱帶農業科學院香料飲料研究所，海南萬寧 571533；3. 海南省遺傳育種與種質資源重點實驗室，海南萬寧 571533；4. 海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質調控重點實驗室，海南萬寧 571533；5. 海南省Sim Soonliang院士工作站，海南萬寧 571533

木質素在植物體中具有運輸水分、支撐植株和加強植物體免受侵害等功能，是苯丙烷代謝途徑的重要產物之一。其中肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）是該途徑中重要的限速酶。本研究在胡椒轉錄組測序的基礎上，用RACE法進行克隆，對基因全長進行生物信息學分析，并對其蛋白進行理化性質、亞細胞定位和系統進化樹等分析；最后運用實時熒光定量PCR進行分析。結果表明：克隆得到基因的全長cDNA，長度為1364 bp，開放閱讀框（open reading frame，ORF）為1071 bp，編碼356個氨基酸，預測相對分子量為3.879 kDa，等電點為6.27，屬于親水性蛋白；含有3個N-糖基化特征序列和9個磷酸化位點，可能處于細胞質內。結構域分析發現，胡椒CAD蛋白含有NAD(P)結合位點、多個催化鋅和結構鋅結合位點。系統進化樹分析表明，胡椒CAD與細辛CAD6親緣關系最近，胡椒和細辛的同源性最高為76%，均隸屬于比較原始的雙子葉植物。通過熒光定量分析發現，黃花胡椒在辣椒疫霉菌侵染下表達量升高，在8 h達到最高值，約為對照的10倍；之后在24 h時出現小幅度升高，約為對照組的6倍，之后下降。‘熱引1號’胡椒的表達量在侵染8 h時達到最低，之后緩慢上升。總體來說，所有時間下黃花胡椒基因表達量均高于‘熱引1號’胡椒，且差異顯著。本研究結果可為今后研究胡椒抗非生物脅迫功能提供參考，為基因的功能研究提供理論依據。

胡椒；；基因克隆；生物信息學分析；熒光定量PCR

胡椒（L.）是海南省重點支持和發展的熱帶特色農業產業之一，更是海南省農業經濟收入的重要來源。此外，海南作為中國最大的胡椒生產區，占據全國胡椒生產總量的90%以上[1]。胡椒在醫學領域和食品工業用途廣泛[2]。胡椒具有4000多年歷史，主要種植在熱帶和亞熱帶，全球種植面積達到60萬hm2。中國是世界第五大胡椒生產國，截至目前中國胡椒種植面積約為2.6萬hm2。現在的主栽品種‘熱引1號’胡椒是由中國熱帶農業科學院香料飲料研究所選育并推廣種植，面積占全國90%以上，但由于其極易感染胡椒瘟病，很大程度上限制了胡椒產業的良性發展[3]。

木質素在植物體中具有運輸水分、支撐植株和加強植物體免受侵害等功能[4-7]，其生物合成是在多種酶的參與下完成的，是苯丙烷代謝途徑的重要產物之一[8]。木質素的生物合成過程可總結為苯丙氨酸或酪氨酸在一系列酶的催化下，逐步轉化為木質素單體，最終聚合成木質素的過程[9]。肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD）是木質素合成過程中的重要限速酶，也是單體合成下游途徑中的重要還原酶，對S型、G型和H型木質素的合成具有一定的作用[4, 10]。肉桂醇脫氫酶屬于中鏈脫氫酶/還原酶家族，在NADPH的作用下可將肉桂醛還原為肉桂醇，是植物細胞壁單信號代謝途徑的最后一步。前人通過正、反義表達和突變體實驗研究表明，植物基因可調整木質素的總量及單體的比例[11]。隋娟娟等[12]對香椿葉片進行高溫、低溫、干旱、鹽脅迫后，發現在非生物脅迫下基因表達量與葉片木質素含量呈顯著正相關；與野生型相比，在擬南芥反義表達基因植株的木質素總量大大降低，并出現倒伏現象[13]；張穎俊[14]研究發現干旱脅迫下油菜基因表達水平與莖稈和根系中的木質素含量均呈顯著正相關；擬南芥和基因同時突變后，木質素含量下降94%[15]。可見，基因在木質素生物合成過程中發揮著重要調控功能。目前，國內外已對多種植物的基因成員進行鑒定，如陸地棉、亞麻、小麥、洋草麥和榅桲等[16-20]，但關于胡椒基因的研究尚未全面開展。胡椒全基因組測序已完成，在此基礎上，本研究中采用RACE方法從葉片上克隆得到1個基因，同時對該基因的生物信息學進行分析。采用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測基因在辣椒疫霉菌侵染及不同時間下葉片的相對表達量，為深入研究在胡椒生長發育及抗瘟病的作用機制提供理論參考，對提高胡椒產量和抗性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為‘熱引1號’胡椒葉片樣本和黃花胡椒葉片樣本，均采集于農業農村部萬寧胡椒種質資源圃。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成 總RNA提取參照李國澤等[21]的改良Trizol法。cDNA第一鏈的合成使用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）。

1.2.2基因克隆 利用已發表的胡椒轉錄組序列，采用Primer Premier 5.0設計引物B497F2和B497R1（F：5?-CAGTAATGAGAATTGT CT-3?；R：5?-TCACTTCAATGATTTCTC-3′）。參照伍寶朵等[22]的PCR擴增程序和體系，PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用PCR產物回收試劑盒回收目的片段，將其連接至pMD18- T后轉化，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 RACE實驗 參照羅聰等[23]和王繼雪等[24]的方法，引物序列見表1。

表1 引物名稱及序列

1.2.4 胡椒的基因和PnCAD蛋白的生物信息學分析 利用NCBI的ORF Finder程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析基因的開放閱讀框及編碼的氨基酸序列；利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析PnCAD蛋白的蛋白序列；利用在線軟件ExPASy ProtScale（https://web.expasy.org/compute_pi/）預測該蛋白質的分子量、等電點和親水性及疏水性；利用SWISS-MODEL軟件（http://swissmodel. expasy.org/）預測PnCAD蛋白的三級結構；利用NCBI的BLAST程序（https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）進行同源性比對分析；利用在線軟件SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）預測分析該基因氨基酸序列功能結構域；利用DNAman進行同源序列比對分析；利用MEGA 7.0軟件鄰接（neighbor joining, NJ）法構建系統進化樹[25-27]。

1.2.5 實時熒光定量PCR 以感病種質‘熱引1號’胡椒和抗病種質黃花胡椒為材料開展病原菌接種，方法及采樣時間參考張葉等[28]的研究，采用Trizol法提取‘熱引1號’胡椒和黃花胡椒葉片總RNA，并利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）試劑盒反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行qPCR檢測。擴增程序：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，55℃退火20 s，進行40個循環，72 ℃延伸10 min。以PUB1為內參[29]，采用2–ΔΔCT法計算基因的相對表達量[30]，采用Origin 8.0軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 胡椒CAD基因的RACE克隆

以胡椒葉片cDNA為模板，PCR擴增得到單一條帶，長度約為1063 bp（圖1）。對cDNA的5￠端和3￠端進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，擴增產物均僅有1條特異性擴增條帶（圖1A、圖1B）。測序結果表明，5￠-RACE和3￠-RACE產物大小分別為178、315 bp，拼接后獲得全長cDNA序列1364 bp，命名為。氨基酸和核苷酸序列對比，該基因有1個1071 bp的完整開放閱讀框，編碼356個氨基酸，起始密碼子和終止密碼子分別為ATG和TGA（圖2）。

M：DL2000 marker；1：PCR產物；A：5′-RACE 產物；B：3′-RACE 產物。

2.2 胡椒PnCAD蛋白生物信息學分析

PnCAD蛋白相對分子量為38.79 kDa，pI為6.27，分子式為C1720H2702N458O514S24，原子總數為5418，脂肪指數為82.92，共有35個氨基酸殘基（Arg+Lys）帶正電荷和39個氨基酸殘基（Asp+Glu）帶負電荷，預測其不穩定指數（II）為29.97，可將此蛋白質定位為穩定蛋白質。親水性總平均值（grand average of hydropathiciy, GRAVY）為?0.062，表明PnCAD為親水性蛋白。預測該蛋白不含有跨膜結構域，編碼區蛋白定位到細胞質中，編碼區蛋白不含有信號肽（圖3）。對基因的氨基酸進行糖基化位點分析，結果顯示有3個存在N-糖基化特征序列，且電勢均超過了閾值0.5，分別是82、208和244，可對這3個位點進行后續研究[31]。磷酸化位點預測結果發現，共有9個磷酸化位點，8個絲氨酸磷酸化位點和1個蘇氨酸磷酸化位點。結果表明PnCAD蛋白共有9個潛在的翻譯后修飾（post-translation modification, PTM）。

黑色方框表示ATG起始密碼子；*表示終止密碼子；雙下劃線表示Poly(A)加尾信號；單下劃綫表示poly(A)序列；圓圈符號為可能的N糖基化位點。藍色方框區域為可能的PnCAD結構域（access No cd05283）；藍色陰影區域表示可能的二聚體界面的結合位置，紅色陰影區域為NADP底物結合位點及催化鋅結合位點，綠色陰影區域為結構鋅結合位點。

圖3 信號肽及跨膜結構分析

2.3 PnCAD蛋白保守結構域和三級結構分析

用SMART在線軟件對PnCAD進行蛋白保守結構域[29]檢測，結果顯示PnCAD蛋白含有CAD1保守結構域和1個NAD(P)結合位點，具有氧化還原酶活性，此外還含有催化鋅結合位點Cys48、His70、Cys165，結構鋅結合位點Cys101、Cys104、Cys107、Cys115，二聚體界面Val114、Thr172、His177、Asn270～Val300、Dimer interface。推測NADP底物結合位點主要由Cys48、Ala50、His70、Thr96、Cys165、Thr301組成（圖4）。SWISS- MODEL構建CDS區三級結構，結果發現與MDR超家族的酶結構很相似。CAD以同源二聚體的形式存在，存在2個鋅離子結合位點，同源二聚體ADs可結合4個鋅離子。其中催化鋅結合位點正好位于底物結合位點的正中心，該NADP底物結合位點主要由其他五部分組成，形成一個凹陷的空腔（圖5）[32]。

圖4 PnCAD蛋白保守區結構預測

圖5 胡椒PnCAD蛋白三級結構預測結果

2.4 PnCAD蛋白序列的多重序列比對和進化分析

利用NCBI Blastp對PnCAD蛋白序列進行同源比對，結果見圖6，其與細辛的氨基酸序列相似性為76%，其CAD酶的CAD1結構域都較為保守，特別是底物結合位點（紅色三角表示）位置的氨基酸殘基保守性非常高，相對來說二聚體結合面的同源性較低。利用MEGA 7.0構建PnCAD和其他物種的CAD氨基酸序列系統發育樹，結果顯示胡椒PnCAD與細辛AsCAD6親緣關系最為接近，隸屬于比較原始的雙子葉植物。與其他雙子葉植物距離較遠，與鳳梨、大米、小麥等單子葉植物聚類在同一個大分支上（圖7）。

2.5 PnCAD基因的表達分析

本研究以為內參基因，以無菌水處理為對照，用病原菌處理8、12、24、48 h后進行表達模式分析。在接水處理中，黃花胡椒的表達量和‘熱引1號’胡椒的基本相似；在病原菌接種8 h時，黃花胡椒的表達量是對照的10倍，隨后表達量降低同時高于對照組；在病原菌接種24 h時，表達量又增高，大約是對照的6倍，之后稍微降低。‘熱引1號’胡椒在接種8 h時，其基因表達量最低，之后逐漸緩慢升高，但所有的接種組都比黃花胡椒含量低，且差異顯著（圖8）。

3 討論

本研究在轉錄組測序基礎上，通過RACE技術克隆胡椒基因，基因大小為1364 bp，編碼356個氨基酸殘基，蛋白質理論分子量大小約為3.879 kDa，預測pI為6.27。PnCAD蛋白屬于親水性蛋白，其中包含9個磷酸化位點和3個N-糖基化特征序列；根據亞細胞定位發現，該蛋白位于細胞質上，且不含有跨膜結構域和信號肽位點，這與在水芹、臘梅中克隆到的基因結果相同[9, 33]。利用網站構建基因的CDS區三級結構，該蛋白的三級結構與MDR超家族的酶結構很相似；對PnCAD蛋白保守結構域進行預測，結果顯示PnCAD蛋白含有CAD1保守結構域，屬于MDR超家族；分析后發現胡椒CAD蛋白含有1個NAD(P)結合位點、多個催化鋅和結構鋅結合位點具有高度保守性。郝麗芬等[19]克隆洋草麥肉桂醇脫氫酶基因的CDS序列，含有多個催化鋅結合位點和底物鋅結合位點，也具有典型的CAD1結構域，與本研究結果基本一致。車玉紅等[20]對榅桲果肉組織中基因的編碼區全序列進行測序和表達分析，結果顯示，在果實發育早期，木質素合成快，基因表達量高，隨著木質素合成速度趨緩，基因的表達量逐漸降低。表明基因表達量與木質素合成呈正相關，與本研究結果基本一致。

圖6 胡椒PnCAD蛋白的氨基酸序列與其他植物CAD的同源性比較

圖7 胡椒PnCAD蛋白的進化樹分析

圖8 PnCAD基因表達結果

本研究發現胡椒和細辛的同源性最高達到76%，同隸屬于比較原始的雙子葉植物，其CAD酶的CAD1結構域均較保守，特別是底物結合位點位置的氨基酸殘基的保守性非常高；在辣椒疫霉菌侵染下，胡椒基因的表達量出現升高，在8 h達到最高值，分析可能是由于病原菌的侵染調節了基因的表達，使PnCAD蛋白維持在相應的水平，說明基因參與調控胡椒瘟病的抗性。另外，胡椒不同抗性種質受辣椒疫霉菌侵染后表達存在差異，接種后抗病種質的表達量均高于感病種質，表明基因的表達模式在不同抗性水平的胡椒種質中也存在一定的差異。目前，對在植物中被病原體感染、輻射等外界刺激所激活而表達基因的研究很多。前人研究表明譚雅芹[34]用灰霉菌侵染野生型和轉化植株，得出超表達轉化株的菌絲形成率低于野生型植株，說明在灰霉菌脅迫下可能通過合成類木質素參與防御反應。劉賀娟[35]對甜瓜幼苗接種枯萎病菌后，植株根、莖、葉中的木質素含量、PAL、CAD等酶活性均有不同程度的升高；除莖外根系和葉片中均有誘導的基因家族成員，甜瓜響應病菌侵染，這與本研究一致。上述研究結果表明，在病原菌侵染下，基因均能通過提高表達來改變植物體內木質素的合成，是較為理想的目標基因。本研究為今后研究胡椒抗非生物脅迫功能提供參考，為的功能研究提供理論依據。

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Cloning and Bioinformatics Analysis of PepperGene by Race

SUN Yeqiao1,2,3, WANG Jue1,2,3, HU Lisong2,3, WU Baoduo2,4, HAO Chaoyun2,4,5, FAN Rui2,4,5*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Institute of Spices and Beverages, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wanning, Hainan 571533, China; 3. Hainan Key Laboratory of Genetics, Breeding and Germplasm Resources, Wanning, Hainan 571533, China; 4. Hainan Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Control of Tropical Spice Beverage Crops, Wanning, Hainan 571533, China; 5. Hainan SIM Soonliang Academician Workstation, Wanning, Hainan 571533, China

Lignin has some functions in plants, such as transporting water, supporting plants and strengthening plants against damage, etc. It is one of the important products of phenylpropane metabolism.Among them, cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) is an important rate-limiting enzyme in the lignin synthesis pathway.In this experiment, on the basis of pepper transcriptome sequencing, the RACE method was used for gene cloning, bioinformatics analysis of the full-lengthgene, and many analyses of its protein such as physicochemical properties, subcellular localization and phylogenetic tree. It was analyzed by qPCR. The cinnamyl alcohol dehydrogenase gene was cloned by the race method. Finally, a full-length cDNA with a length of 1364 bp was obtained, including 1071 bp open reading frame (ORF), encoding 356 amino acids. The predicted relative molecular weight was 3.879 kDa and the isoelectric point was 6.27. It belonged to hydrophilic protein.It contained three N-glycosylation characteristic sequences and nine phosphorylation sites, which were likely to be in the cytoplasm. Domain analysis showed that CAD protein contained NAD (P) binding sites, multiple catalytic zinc and structural zinc binding sites. Phylogenetic tree analysis showed that pepper CAD was closely related toCAD 6, and the highest homology was 76%, both of which belonged to primitive dicotyledons. Through fluorescence quantitative analysis, it could be found that the expression ofunder the infection ofincreased, reached the highest value at 8 h, about 10 times that of the control, then increased slightly at 24 h, about 6 times that of the control group, and then decreased. Generally speaking, the gene expression level ofat all time was higher than that ofcv.and was significantly different. The experimental data could provide reference data for the future study of the anti abiotic stress function of black pepper, and also provide a theoretical basis for the functional study of gene.

;; gene cloning; bioinformatics analysis; qPCR

S961.6

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.004

2022-03-28；

2022-06-23

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（No. 1630142020001）。

孫也喬（1998—），女，碩士研究生，研究方向：作物抗逆分子育種。*通信作者（Corresponding author）：范 睿（FAN Rui），E-mail：tlfr83@163.com。