化學(xué)萃取同種異體肌腱重建兔跟腱缺損的研究

陳國(guó)飛，薛小華，蔡繁繁，陳侯磬，羅鵬，江長(zhǎng)青，郭偉明

（1.華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院 運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518052；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院創(chuàng)傷骨關(guān)節(jié)科，廣東 深圳 518000）

跟腱損傷是常見的運(yùn)動(dòng)損傷，常因外傷引起。跟腱缺損常見于二次損傷或跟腱感染，需要外科手術(shù)治療[1]。跟腱缺損常用的外科手術(shù)方式為V-Y翻轉(zhuǎn)或肌腱移植。V-Y翻轉(zhuǎn)成形術(shù)損傷大[2]，肌腱移植可選用自體肌腱及異體肌腱，自體肌腱需二次創(chuàng)傷，應(yīng)用同種異體肌腱移植修復(fù)陳舊性跟腱斷裂，根據(jù)缺損長(zhǎng)短可提前制作供材，不僅減少了自體肌腱取材時(shí)造成的二次損傷及其引起的相關(guān)并發(fā)癥，并且簡(jiǎn)化了手術(shù)方法，縮短了手術(shù)時(shí)間[3]。本次研究化學(xué)萃取同種異體肌腱在跟腱缺損移植中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、儀器

成年雄性新西蘭大白兔45只，體重2.5～3.0kg，由北京華富康有限公司提供。將動(dòng)物分成四組，其中一組將15只兔處死后取出雙側(cè)肌腱進(jìn)行化學(xué)萃取處理，再將處理后肌腱回植至剩余30只兔子跟腱缺損處，并將兔子分成三組，每組10只，分別于術(shù)后6周、12周、24周抽取外周血并處死后取出移植肌腱進(jìn)行組織學(xué)及生物力學(xué)對(duì)比。

1.2 跟腱取材及化學(xué)萃取

取材：新西蘭大白兔予7%水合氯醛于耳緣靜脈注射麻醉，后腿備皮，剪開腿部皮膚，暴露肌肉組織以及肌腱，分離肌肉充分暴露肌腱，剪下肌腱，注意避免操作過(guò)程中夾取或牽拉肌腱。

萃取方法：⑴100mL滅菌蒸餾水中水平振蕩6h，滅菌蒸餾水沖洗三遍；⑵4%Triton X-100約100 mL中水平振蕩12 h，滅菌蒸餾水沖洗三遍；⑶滅菌蒸餾水100 mL中水平振蕩6 h，滅菌蒸餾水沖洗三遍；⑷4%脫氧膽酸鈉液約100 mL中水平振蕩12 h，滅菌蒸餾水沖洗三遍；⑸滅菌蒸餾水100mL中水平振蕩12h。

1.3 跟腱損傷模型建立

將剩余的30只兔子腹腔注射7%水合氯醛（0.5 mL/100 g）麻醉后，將兔子后腿消毒刮毛，切開跟腱外層皮膚4.0 cm，分層顯露皮下組織，顯露兔跟腱處，切除跟腱2.0 cm，制作跟腱缺損，再將已制備好的萃取同種異體肌腱移植至跟腱缺損處，縫合固定連接同種異體肌腱，沖洗傷口，縫合切口。術(shù)后將手術(shù)的后腿用管型石膏固定于屈曲40°位。

所有兔子術(shù)后均在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心按標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，晝夜規(guī)律正常。術(shù)后動(dòng)物無(wú)不明原因死亡、自殘、傷口感染、跖底潰瘍等現(xiàn)象。術(shù)后3周將石膏外固定去除，任其自由活動(dòng)。在術(shù)后6周、12周、24周時(shí)，分別隨機(jī)取6只移植組動(dòng)物處死后取出移植肌腱用于觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)

1.4.1 大體觀察指標(biāo)

觀察兔手術(shù)后傷口愈合情況、術(shù)后肢體的活動(dòng)度、行走步態(tài)，并在取標(biāo)本時(shí)觀察移植肌腱縫合處愈合情況及大體形態(tài)。

1.4.2 組織學(xué)檢查

將標(biāo)本取出后，將未移植的萃取后跟腱組織和移植后不同時(shí)期的體內(nèi)異體跟腱，進(jìn)行病理切片、HE染色，Masson及電鏡觀察不同時(shí)期和不同種類的跟腱及縫合口的組織學(xué)變化。

1.4.3 免疫源性檢測(cè)

分別于術(shù)后6周、12周、24周抽取三組動(dòng)物的外周血2 mL，然后在EDTA-K2抗凝管中放置混勻，在4℃的溫度下冷藏保存?zhèn)溆?，檢測(cè)時(shí)間控制在2 h內(nèi)。添加并混合8μL的抗體D4(CT-4)FITC和8μL的抗體CD8-α(CT-8)FITC。標(biāo)記，將5μL的雞血加入其中，在37℃孵育箱中進(jìn)行1 h的避光孵育。對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行裂解。上機(jī)對(duì)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4 生物力學(xué)檢測(cè)

移植肌腱拉伸斷裂強(qiáng)度檢測(cè)中，肌腱兩端用紗布包裹，然后將其固定在檢測(cè)儀兩端，檢測(cè)時(shí)用生理鹽水不斷噴濕肌腱，防止風(fēng)干對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。將肌腱拉伸至完全斷裂，拉伸速度為10 mm/min，在肌腱拉伸斷裂檢測(cè)過(guò)程中，用相應(yīng)軟件詳細(xì)記錄結(jié)果；在檢測(cè)肌腱拉伸斷裂延伸率過(guò)程中，延伸率計(jì)算方法為（拉伸斷裂長(zhǎng)度-初始長(zhǎng)度）/初始長(zhǎng)度×100%[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大體觀察結(jié)果

兔跟腱在移植后2周內(nèi)可見術(shù)側(cè)無(wú)法行走，呈跛行狀態(tài)，3周后拆除石膏并拆線，可觸及皮下跟腱，有連續(xù)性。行走狀態(tài)較前改善，但術(shù)側(cè)活動(dòng)幅度較對(duì)側(cè)明顯降低，肌力低于正常。4周后，仍步態(tài)異常，速度慢。皮下肌腱觸及可推動(dòng)，肌腱增粗增大，肌腹腱連續(xù)性存在。雙后肢活動(dòng)幅度仍較正常降低，肌力較前增強(qiáng)。8周時(shí)兔可正常行走，步態(tài)無(wú)明顯異常，速度仍較正常組慢，可輕松地推動(dòng)皮下跟腱，連續(xù)性好。24周后兔術(shù)側(cè)跟腱連續(xù)性好，無(wú)活動(dòng)障礙，肌力正常。

從大體形態(tài)上，3周拆除石膏后，跟腱連續(xù)性存在，6周時(shí)移植跟腱增生，未觸及明顯增粗，12周時(shí)可觸及明顯瘢痕硬組織，24周后形態(tài)接近正常組織，無(wú)明顯硬化及增粗。

2.2 組織切片觀察結(jié)果

6周時(shí)組織病理切片可見少許血管增生長(zhǎng)入，肌腱組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，連續(xù)性存在；8周時(shí)肌腱組織排列較整齊，可有膠原纖維長(zhǎng)入，伴有局部壞死區(qū)；24周后可見腱組織排列整齊，腱束內(nèi)未見明顯壞死組織。

2.3 生物力學(xué)檢測(cè)

生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果（±s）

表1 生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果（±s）

組別 拉伸強(qiáng)度（M P a） 最大拉伸（m m） 斷裂伸長(zhǎng)率（%）6周 1 5 9.0 0±3 5.0 0 2.6 9±0.8 9 1 8.8 6±1.3 7 1 2周 1 6 8.0 0±3 1.0 0 2.8 0±0.5 0 2 0.3 2±1.2 8 2 4周 1 7 6.0 0±2 3.0 0 3.3 1±0.7 4 2 2.0 4±1.3 1 P值 0.0 0 2 0.0 0 0 0.0 0 0

2.4 HE染色對(duì)比

在400X顯微鏡下，從6周開始可見同種異體肌腱組織內(nèi)有細(xì)胞組織長(zhǎng)入，12周細(xì)胞核逐漸增多，24周內(nèi)肌腱組織HE染色可見肌腱內(nèi)布滿細(xì)胞核（圖1-3）。

圖1-3 400×顯微鏡下6周見細(xì)胞組織長(zhǎng)入;12周見細(xì)胞核逐漸增多；24周見布滿細(xì)胞核

2.5 免疫源性檢測(cè)

6周、12周和24周檢測(cè)外周血CD+4、CD+8T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)所占比例及CD+4/CD+8比值，任兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 免疫源性檢測(cè)結(jié)果（±s）

表2 免疫源性檢測(cè)結(jié)果（±s）

組別 C D+4 C D+8 C D+4/C D+8 6周 3 5.0±7.0 1 3.2±1.2 2.4±0.2 1 2周 3 1.0±7.0 1 4.5±1.1 2.1±0.1 2 4周 2 6.0±7.0 1 6.3±1.5 1.5±0.3 P值 0.0 0 1 0.0 0 0 0.0 0 0

2.6 Masson染色觀察

術(shù)后6周、12周、24周分別取肌腱標(biāo)本，常規(guī)行Masson染色觀察肌腱內(nèi)纖維組織情況。通過(guò)觀察可見，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，化學(xué)萃取肌腱內(nèi)纖維組織增多，排列更有序緊湊（圖4-6）。

圖4-6 6周、12周、24周肌腱內(nèi)顯微組織情況

2.7 利用電鏡掃描

觀察6周、12周、24周化學(xué)萃取異體肌腱在電鏡微觀下的結(jié)構(gòu)，通過(guò)電鏡掃描可見纖維組織膠原纖維隨時(shí)間推移增多（圖7-9）。

圖7-9 電子顯微鏡掃描(2 000×)見顯微組織膠原纖維變化

3 討論

跟腱損傷常見于運(yùn)動(dòng)損傷，目前的主要治療方式為外科手術(shù)。對(duì)于伴有跟腱缺損的手術(shù)方式可選擇肌腱移植[4-5]，肌腱來(lái)源包括自體肌腱及同種異體肌腱。自體肌腱雖無(wú)排斥反應(yīng)[6]，但來(lái)源有限，難以滿足臨床需求，且取自體肌腱會(huì)增加患者創(chuàng)傷。而同種異體肌腱來(lái)源廣泛，能夠滿足臨床需求，但其應(yīng)用面臨免疫排斥反應(yīng)的問(wèn)題[7-8]，目前采用的同種異體肌腱均為處理后無(wú)抗原移植物。同種異體肌腱的選擇需要肌腱纖維結(jié)構(gòu)，具備破壞小、力學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定特點(diǎn)。而采用化學(xué)萃取后同種異體肌腱既處理了抗原，又能夠較好地保留肌腱的生物力學(xué)性能，是作為跟腱缺損后移植重建的較好選擇。

肌腱的愈合可以分為炎癥期、增殖期和重塑期。炎癥期在受傷后不久發(fā)生，組織形成血腫，細(xì)胞通過(guò)這些血腫進(jìn)行傳遞[9]。而異體移植的肌腱主要經(jīng)歷壞死、血管化、細(xì)胞增值、塑形階段。在移植早期可見到化學(xué)萃取異體肌腱移植后出現(xiàn)纖維結(jié)構(gòu)的溶解，很少有細(xì)胞長(zhǎng)入，并且肌腱移植后會(huì)出現(xiàn)纖維瘢痕增生，隨后進(jìn)入細(xì)胞增殖期。而到了移植中期，這時(shí)肌腱會(huì)開始增粗，肌腱中的Ⅲ型膠原蛋白隨后逐漸被Ⅰ型膠原蛋白替代，可見到移植細(xì)胞的長(zhǎng)入，通過(guò)HE染色以及電子纖維鏡下可見移植肌腱上有較多的細(xì)胞長(zhǎng)入，使其更為牢固。大約12周后，成熟階段開始，主要是膠原纖維的不斷交聯(lián)和形成腱組織實(shí)質(zhì)[10]。在本實(shí)驗(yàn)中的第12周肌腱明顯增粗，而隨著時(shí)間的推移，肌腱的愈合會(huì)進(jìn)入重塑期，重塑期又包括兩個(gè)階段：鞏固期和成熟期[11]。重塑期肌腱會(huì)變得更有韌性和彈性，而且塑形后的肌腱變得柔軟，接近正常的跟腱組織，力學(xué)性能也能更加接近原有的跟腱組織。后期HE染色觀察可見化學(xué)萃取后肌腱內(nèi)布滿了細(xì)胞核。24周時(shí)，從電鏡下觀察細(xì)胞的長(zhǎng)入是最多的。

根據(jù)研究表明，CD4+T、CD8+T兩個(gè)淋巴細(xì)胞亞群參與機(jī)體免疫排斥反應(yīng)主要是通過(guò)細(xì)胞免疫和體液免疫兩個(gè)過(guò)程協(xié)同作用[12]。二者比值的變化常作為移植后排斥反應(yīng)的指標(biāo)[13]，化學(xué)萃取肌腱移植后不同時(shí)間的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均有明顯差異，在移植后6周時(shí)的轉(zhuǎn)化率最大，第24周的轉(zhuǎn)化率明顯低于其他組，第12周的轉(zhuǎn)化率明顯低于第一組，說(shuō)明隨著移植后時(shí)間的推移，移植后的肌腱細(xì)胞免疫原性越來(lái)越低，隨著自體細(xì)胞的長(zhǎng)入替代，移植后的肌腱組織逐漸形成自體肌腱。

從力學(xué)結(jié)構(gòu)上，最初化學(xué)萃取后的肌腱組織在彈性模量和最大負(fù)荷是最小的，隨著移植后時(shí)間的推移，肌腱的彈性模量和最大負(fù)荷都在增加，24周后達(dá)到最大值，不同時(shí)間組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而到12周以后，與24周的差異較小，說(shuō)明隨著時(shí)間推移，移植肌腱在細(xì)胞長(zhǎng)入后力學(xué)性能逐漸穩(wěn)定。

綜上所述，化學(xué)萃取法同種異體肌腱既保留了原有的纖維機(jī)構(gòu)和生物力學(xué)性能，又降低了免疫原性，可為臨床提供良好的供材。