基于公共數據庫分析自噬相關基因在肺腺癌患者中的預后意義

李 敖，王玉然，王文浩

（濰坊醫學院附屬醫院腫瘤科1，放療科2，山東 濰坊 261041）

截至2020 年，肺癌發病率位居第2 位，死亡率高居首位[1，2]。肺腺癌是肺癌常見的組織學亞型之一。肺癌發病機制、進展及耐藥的分子機制是肺癌精確治療的研究熱點，也是藥物治療的關鍵。可靠的生物標志物對于肺癌的準確診斷和治療至關重要。研究發現[3]，自噬在非小細胞肺癌的發展、治療和耐藥中起重要作用。自噬是發生在特定生物過程中，由多種信號通路調控的一種細胞程序性死亡方式[4]，其可參與腫瘤生長調控[5，6]。在肺癌細胞學實驗中，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑可以激活自噬。本研究利用生物信息學方法對肺腺癌中自噬相關基因（autophagy-related genes，ATGs）的差異表達進行分析，根據Cox 分析建立ATGs 的預后模型，以期為ATGs 在肺腺癌患者預后評估和靶向治療中的應用提供新的研究方向，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據來源 肺腺癌基因表達數據及相關臨床基礎數據來源于TCGA 數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）。從TCGA 數據庫獲取54 例正常組織和497 例腫瘤組織的RNA 測序數據，并獲取相應的臨床數據。利用R 軟件對樣本中的差異表達基因進行Wilcox 檢驗。從人類自噬數據庫HADb（http://www.autophagy.lu/）中共檢索到232 個ATGs。為了篩選差異表達的ATGs，閾值設定為logFC＞1.0，FDR＜0.05。

1.2 GO 和KEGG 對差異表達ATGs 富集分析 使用R 軟件進行GO 富集分析和KEGG 富集分析，其中GO 富集分析包括生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cell components，CC）和分子功能（molecular functions，MF）3 類。使用公共蛋白質相互作用數據庫PPI（https://string-db.org/）生成差異ATGs 的蛋白質相互作用網絡，使用Cytoscape 軟件（3.7.2 版）編輯蛋白質相互作用圖像。

1.3 預后模型構建 應用R 軟件進行單因素Cox 分析，篩選出與肺腺癌預后相關的差異表達基因。利用多變量Cox 回歸分析構建肺腺癌ATGs 的預后模型。使用特定的公式計算風險評分，用中位風險閾值將肺腺癌患者分為高危和低危2 組。應用Kaplan-Meier 分析風險評分與肺腺癌患者預后的關系。

1.4 統計學方法 所有統計分析采用R 軟件（4.0.4 版）進行。采用對數秩檢驗和K-M 分析法繪制生存曲線。單因素和多因素分析采用Cox 比例風險回歸模型。用雙側t檢驗進行風險評分與臨床參數的統計比較。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ATGs 的差異表達分析 以TCGA 數據庫中54例正常組織和497 例肺腺癌組織的mRNA 陣列分析為基礎，以絕對mRNA 基因表達水平logFC＞1.0 和FDR＜0.05 為篩選標準進行ATGs 的差異表達分析。R 軟件包“limma”和“ggpubr”分析共獲得200 個ATGs。ATGs 分布散點圖見圖1A。以LogFC＞1.0 和P＜0.05 為選擇標準，篩選出在肺腺癌數據庫中差異表達的30 個ATGs，見圖1B、1C。

圖1 ATGs 在肺腺癌TCGA 數據庫中的差異表達

2.2 ATGs 的功能富集分析 在生物學過程中，GO 最顯著富集的前3 個功能是內源性凋亡信號通路、巨噬細胞自噬和神經元死亡，細胞成分包括自噬小體、自噬體膜和內質網伴侶復合體。在分子功能上，ATGs 主要是濃縮蛋白磷酸酶結合、磷酸酶結合和蛋白二硫鍵異構酶活性。KEGG 通路富集分析顯示，這些基因與自噬（動物）通路、ErbB 信號通路和IL-17信號通路相關。此外，從在線STRING 數據庫中獲得了30 個ATGs 的蛋白互作網絡，見圖2。

圖2 GO 和KEGG 富集功能分析與PPI 網絡構建

2.3 自噬相關危險因素與肺腺癌預后關系的研究對200 個ATGs 進行單因素Cox 回歸分析，從肺腺癌TCGA 數據庫（圖3A）中獲得了21 個預后相關ATGs，其中9 個ATGs（ATG4A、NLRC4、PRKCD、DAPK2、SIRT2、CCR2、ATG16L2、DLC1、DRAM1）被認為是保護性基因（HR＜1），其余12 個ATGs（ITGB4、BIRC5、CTSL、SPHK1、APOL1、ITGA6、ITGB1、GAPDH、ERO1A、EIF2S1、MBTPS2、ST13）被認為是危險性基因（HR＞1）。通過多因素Cox 回歸分析，從21 個ATGs 中篩選出與肺腺癌患者預后相關的8個關鍵基因（ATG4A、CCR2、MBTPS2、APOL1、ERO1A、SPHK1、ST13 和ITGA6），見表1。通過多因素Cox 回歸分析得到了各危險基因的系數值，根據ATGs 公式構建自噬預后模型：風險評分=（-0.5562×ATG4A表達值）+（-0.3777×CCR2 表達值）+（0.3398×MBTPS2）+（0.1319 ×APOL1 表達值）+（0.2030 ×ERO1A 表達值）+（0.1832 ×SPHK1 表達值）+（0.2893×ST13 表達值）+（0.1399×ITGA6 表達值）。根據此公式，從TCGA 數據庫獲得患者的預后風險評分。圖3B 顯示了肺腺癌患者的風險評分分布，圖3C顯示了生存時間和風險評分之間的相關性。建立熱圖分析低風險組和高風險組中包含的8 個ATGs 的表達差異（圖3D），結果顯示高危組患者傾向于表達危險基因，而低危組患者傾向于表達保護基因。

圖3 自噬相關的危險因素與肺腺癌患者預后的關系

表1 肺腺癌預后基因中的8 個關鍵ATGs 列表

2.4 自噬在肺腺癌是一個獨立的預后指標 單因素和多因素預后分析顯示，風險評分是肺腺癌TCGA的獨立預后指標（P＜0.05），見圖4A、4B。Kaplan-Meier 曲線分析顯示，高危評分患者的生存期短于低危評分患者，見圖4C。與年齡（AUC=0.567）、性別（AUC=0.617）、分期（AUC=0.708）、T 分期（AUC=0.664）、M 分期（AUC=0.506）和N 分期（AUC=0.632）因素相比，風險評分（AUC=0.763）具有更好的預測性能，見圖4D。

圖4 ATGs 與肺腺癌患者的關系

3 討論

自噬是由一系列ATGs 介導的涉及自噬小體、溶酶體的形成以及細胞器或細胞質的降解過程[7，8]。它可以由缺氧、饑餓、輻射、生長因子信號抑制劑、化療和靶向藥物誘導[9]。近年來，ATGs 在調節細胞內轉運、內吞、胞吐、巨噬細胞吞噬和外泌體產生等方面的作用受到越來越多的關注[10-12]。研究表明[13，14]，自噬在腫瘤的發生發展中起著雙向作用。自噬不僅能有效地抑制腫瘤的凋亡、壞死和炎癥進展，而且在抑制腫瘤的發生和發展方面也起到了一定的作用。在這種情況下，自噬是對身體的一種保護作用。腫瘤細胞可以通過自噬途徑逃避外源抑制物的殺傷作用，從而使腫瘤繼續發展，而在這種情況下，自噬起到了促進腫瘤生長的作用。

本研究分析了從肺腺癌TCGA 數據庫中獲得的200 個ATGs 的表達情況，同時通過GO 和KEGG 分析研究了分子和生物學途徑的富集，GO 富集發現細胞成分和生物學過程與自噬密切相關。從分子功能的角度看，蛋白磷酸酶結合與自噬密切相關。研究發現[15]，通過蛋白磷酸酶2A 抑制脯氨酰寡肽酶可以激活自噬。此外，在KEGG 分析中，最重要的途徑被富集在自噬中。基于以上結果，特異性自噬可能是肺腺癌發生發展過程中的一種腫瘤促進劑。此外，單因素Cox 回歸分析顯示，21 個ATGs 與肺腺癌患者的生存有關。隨后，通過多因素Cox 回歸分析確定了8 個關鍵ATGs（ATG4A、CCR2、MBTPS2、APOL1、ERO1A、SPHK1、ST13、ITGA6）。研究發現[16]，ATG4A對肺癌的預后有重要影響。同時，有報道稱[17]，miRNA可以調節ATG4A 的表達參與自噬的調節。CCL2 可以與腫瘤細胞表面的CCR2 結合，通過CCL2/CCR2分子軸促進腫瘤細胞的增殖、侵襲等惡性生物學行為[18]。ERO1A 在非小細胞肺癌中高表達，與腫瘤細胞的增殖和遷移有關[19]。SPHK1 也與肺癌的惡性生物學行為有關[20]，參與了一些細胞自噬的調節。ST13在正常粘膜組織和相應的腫瘤組織中均有不同程度的表達[21]，miRNA 可以在轉錄后水平調控ITGA6 的表達。另有研究發現[11]，miR-126 和miR-143-3p 分別能抑制ITGA6 的表達，從而抑制非小細胞肺癌的侵襲和轉移。本研究通過計算ATGs 的mRNA 表達值和風險系數得到風險評分，并根據風險評分對患者進行分層，結果顯示自噬基因可作為肺腺癌的獨立預后指標，且ROC 分析顯示，與年齡（AUC=0.567）、性別（AUC=0.617）、分期（AUC=0.708）、T 分期（AUC=0.664）、M 分期（AUC=0.506）和N 分期（AUC=0.632）因素相比，風險評分（AUC=0.763）具有更好的預測性能。

綜上所述，本研究構建了基于8 個ATGs（ATG4A、CCR2、MBTPS2、APOL1、ERO1A、SPHK1、ST13、ITGA6）的預后特征模型，為ATGs 在肺腺癌臨床中的應用奠定了基礎。自噬基因和預后模型可能為改善肺腺癌患者的生存和預后提供新的分子生物標志物及腫瘤驅動基因，有助于制定個體化治療策略。