不同品種不結球白菜高通量表型特征分析

高 璐,李曉鋒,奚丹丹,朱玉英,朱紅芳

(上海市農業科學院設施園藝研究所∕上海市設施園藝技術重點實驗室,上海 201106)

1997年,Schork首次提出表型組學這一概念[1]。已有研究表明,植物表型受基因型和環境共同作用,可通過測量植株長、寬、高以及緊密度和開展面積度、葉形態(如葉片長度、葉片寬度、葉片數量等)來衡量[2]。傳統的植物表型信息采集方法存在樣本量小、效率低、誤差大等缺點,無法適應大批量、快速、準確、無損的表型測量要求,已成為制約植物生物學研究的重要因素[3]。

近幾年,高通量測序技術快速發展,加速了對植物重要性狀基因的挖掘。隨著科研需求的增長及成像傳感器技術的發展,高通量、高效率、高精度、低誤差的自動表型信息采集技術已逐步應用到各個作物中[4]。AgriPhenoTM開放式科研平臺由上海澤泉科技股份有限公司在上海浦東孫橋現代農業園區投資建設,是國內第一家為植物科研和育種提供高通量植物表型分析、植物基因型分析、以及植物表型-基因型聯合分析服務的平臺[2],該平臺引進了目前全球先進的與表型植物育種相關的設施和設備,如全自動高通量植物3D成像系統Scanalyzer 3D,能全自動、高通量對植物等小型樣品進行可見光成像、近紅外成像,通過可見光成像可以測量植物的寬度、密度、葉長、葉寬、葉面積、葉顏色、種子顏色等50多個參數,通過近紅外成像可以分析植物的水分分布狀態、水力學研究、脅迫生理學研究等。植物多酚-葉綠素測量計Dualex Scientific+,可實時非破壞測量植物葉片多酚和葉綠素含量、葉片表層類黃酮和花青素含量等。

不結球白菜(Brassica campestrisssp.chinensis Makino),為十字花科蕓薹屬白菜亞種,俗稱青菜、小白菜,原產中國,占長江中下游各大、中城市蔬菜總復種面積的30%—40%,深受消費者喜愛,具有營養豐富、生長快速、適應性廣、成本低等特點[5]。目前,通過高通量平臺研究不結球白菜的表型特征方面的研究很少,本試驗借助上海澤泉科技股份有限公司的AgriPhenoTM開放式科研平臺分析不同植物在不同生長時期的生長指標和農藝性狀,旨在為蔬菜栽培和育種提供更多表型數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年6—7月在上海市農業科學院和上海澤泉科技股份有限公司進行,供試材料為上海市農業科學院設施園藝研究所提供的不結球白菜品種‘海青2號’、‘新夏青5號’、‘紫衣’、‘華王’和‘植潤988’,其中‘華王’和‘植潤988’為對照材料。2020年6月1日進行播種,采用穴盤育苗,6月17日,選擇兩葉一心、生長勢一致的幼苗移栽到22 cm的白色花盆中,栽培基質為2∶1∶1(體積比)的草炭、蛭石和珍珠巖的混合物。每個品種選取3株進行指標測定。

1.2 測定方法

使用德國LemneTec公司Scanalyzer 3D對正常培養的不結球白菜進行無損成像,分別獲得1張植株頂部、1張植株側面的RGB圖像。分別在6月24日(播種后第24天)、7月1日(播種后第31天)、7月8日(播種后第38天)進行拍攝計算植株的長、寬、株高、緊密度、開展面積以及植株相對含水量等指標。

利用植物多酚-葉綠素測量計Dualex Scientific+,對植株進行實時非破壞性測量,獲得植物葉片葉綠素(Chl)、葉片表層類黃酮(Flav)和花青素(Anth)指數,并通過葉綠素和類黃酮的比值評估植物氮的狀態,即氮平衡指數(NBI=Chl∕Flav)[6]。數據測定的時間和次數同表型測定一致。

1.3 統計分析

利用Microsoft Excel 2010軟件進行數據統計,用Duncan’s新復極差法(LSR,P=0.05)進行差異顯著性檢驗,結果以平均值±標準誤差表示,通過Microsoft Excel 2010和ORGIN 2018進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不結球白菜表型及分析圖的獲得

不結球白菜生長發育過程中植株表型的變化通過高通量表型平臺進行圖片采集及分析。可見光和近紅外進行表型成像后,獲得植株側面1張及其可見光分析圖、頂部1張及其可見光分析圖,以及頂部紅外分析圖(圖1)。

圖1 5種不結球白菜頂部和側面表型及分析圖Fig.1 The top and side phenotype graphics of 5 non-heading Chinese cabbage varieties

2.2 植株表型特征分析

由表1、2、3可知,在不結球白菜生長周期內,5個品種植株的長、寬、株高以及緊密度和開展面積逐漸增大。播種后第24天,‘新夏青5號’的面積最大,比‘華王’和‘植潤988’分別大88.32%、11.89%;緊密度最大的為‘海青2號’,比‘華王’和‘植潤988’分別大28.57%、7.46%;長度最大的為‘新夏青5號’,比‘華王’和‘植潤988’分別大20.00%、15.67%;‘紫衣’的長和寬比‘華王’分別大31.30%、61.09%、比‘植潤988’分別大6.61%、16.16%。

表1 播種后第24天時5種不結球白菜的植株表型特征分析Table 1 Plant phenotypic characteristics of 5 non-heading Chinese cabbage varieties at the 24th day after sowing

播種后第31天,‘新夏青5號’的面積比‘華王’大82.90%,與‘植潤988’無明顯差異,‘新夏青5號’的長和寬最大,其中,長和對照并無明顯差異,寬比‘華王’大42.84%,與‘植潤988’無明顯差異;緊密度最大的為‘海青2號’,比‘華王’和‘植潤988’分別大31.03%、13.43%;‘紫衣’的株高最大,但與對照無明顯差異。

表2 播種后第31天時5種不結球白菜的植株表型特征分析Table 2 Plant phenotypic characteristics of 5 non-heading Chinese cabbage varieties at the 31st day after sowing

播種后第38天,‘紫衣’的面積比‘華王’大47.31%,與‘植潤988’無明顯差異,‘紫衣’的長和寬最大,其中長和對照并無明顯差異,寬比‘華王’大17.24%,與‘植潤988’無明顯差異;緊密度最大的為‘海青2號’,比‘華王’和‘植潤988’分別大16.90%、9.21%。

表3 播種后第38天時5種不結球白菜的植株表型特征分析Table 3 Plant phenotypic characteristics of 5 non-heading Chinese cabbage varieties at the 38th day after sowing

2.3 不結球白菜的相對含水量分析

植株相對含水量主要是通過近紅外成像獲得,級數越小,灰度值越小,對應的含水量越高[7]。植株頂部近紅外成像共分為10級,灰度值介于100—220。從圖2可知,播種后第24天,5份材料的相對含水量均主要集中在2—3級,占比約90%。其中,相對含水量為2級材料中,按照相對含水量高低,依次為‘海青2號’(58.94%)＞‘紫衣’(33.50%)＞‘華王’(28.44%)＞‘植潤988’(2.34%)＞‘新夏青5號’(21.92%);相對含水量為3級的材料中,按照相對含水量高低,依次為‘新夏青5號’(75.87%)＞‘植潤988’(73.05%)＞‘華王’(70.10%)＞‘紫衣’(65.71%)＞‘海青2號’(40.55%)。播種后第31天,5份材料的相對含水量主要集中在3—5級,占比約90%,4級相對含水量材料最多,按照相對含水量高低,依次為‘植潤988’(73.35%)＞‘海青2號’(71.86%)＞‘新夏青5號’(70.56%)＞‘華王’(67.66%)＞‘紫衣’(66.12%)。播種后第38天,5份材料的相對含水量主要集中在2—3級,占比約90%。在3級相對含水量材料中,按照相對含水量高低,依次為‘海青2號’(70.00%)＞‘紫衣’(67.63%)＞‘華王’(67.08%),‘植潤988’(48.87%)＞‘新夏青5號’(48.32%)。

圖2 不結球白菜頂部相對含水量分析Fig.2 Relative water content on top of non-heading Chinese cabbage varieties

植株側面近紅外成像共分為10級,灰度值介于30—230。從圖3可知,播種后第24天,5份材料的相對含水量主要集中在3—5級,占比約90%。在3級相對含水量材料中,按照相對含水量高低,依次為‘植潤988’(40.26%)＞‘新夏青5號’(38.68%)＞‘海青2號’(30.03%)＞‘華王’(29.21%)＞‘紫衣’(20.27%);在4級相對含水量材料中,按照相對含水量高低,依次為‘華王’(52.58%)＞‘海青2號’(46.88%)＞‘紫衣’(44.60%)＞‘新夏青5’(34.45%)＞‘植潤988’(22.45%)。播種后第31天,5份材料的相對含水量均主要集中在6—8級,占比約90%。在6級相對含水量中,按照相對含水量高低,依次為‘紫衣’(48.17%)＞‘海青2號’(39.65%)＞‘新夏青5號’(38.40%)＞‘華王’(29.60%)＞‘植潤988’(26.97%);在7級相對含水量材料中,按照相對含水量高低,依次為‘植潤988’(46.08%)＞‘華王’(45.59%)＞‘新夏青5號’(40.89%)＞‘海青2號’(38.48%)＞‘紫衣’(18.47%)。播種后第38天,‘海青2號’、‘新夏青5號’、‘華王’相對含水量均主要集中在5—7級,占比約90%,‘紫衣’、‘植潤988’相對含水量均主要集中在4—8級,占比約90%。在6級相對含水量材料中,按照相對含水量高低,依次為‘華王’(52.06%)＞‘海青2號’(49.82%)＞‘新夏青5號’(29.71%)＞‘植潤988’(28.48%)＞‘紫衣’(24.37%)。

圖3 不結球白菜側面相對含水量分析Fig.3 Relative water content on the side of non-heading Chinese cabbage varieties

葉片頂部近紅外成像共分為10級,灰度值介于100—220。從圖4可知,播種后第24天,5份材料的相對含水量均主要集中在2—3級,占比90%以上。在2級相對含水量材料中,‘海青2號’最大,為69.62%。在4級相對含水量材料中,按照相對含水量高低,依次為‘華王’(74.24%)＞‘新夏青5號’(72.42%)＞‘紫衣’(70.90%)＞‘植潤988’(68.26%)＞‘海青2號’(29.92%)。播種后第31天,5份材料的相對含水量均主要集中在3—5級,占比95%以上。在4級相對含水量材料中,按照相對含水量高低,依次為‘新夏青5號’(78.21%)＞‘植潤988’(78.15%)＞‘海青2號’(77.39%)＞‘紫衣’(75.18%)＞‘華王’(59.18%)。在5級相對含水量材料中,按照相對含水量高低,依次為‘華王’(32.61%)＞‘紫衣’(20.32%)＞‘植潤988’(16.07%)＞‘新夏青5號’(13.88%)＞‘海青2號’(8.60%)。播種后第38天時,‘海青2號’、‘新夏青5號’、‘華王’相對含水量均主要集中在2—3級,占比90%以上,在2級相對含水量中,按照相對含水量高低,依次為‘新夏青5號’(46.67%)＞‘植潤988’(30.76%)＞‘紫衣’(23.41%)＞‘華王’(17.36%)＞‘海青2號’(16.03%)。在3級相對含水量材料中,按照相對含水量高低,依次為‘海青2號’(81.28%)＞‘華王’(77.57%)＞‘紫衣’(71.47%)＞‘植潤988’(65.14%)＞‘新夏青5號’(50.24%)。

圖4 不結球白菜葉片相對含水量分析Fig.4 Relative water content on leaf of non-heading Chinese cabbage varieties

2.4 光合作用色素指數分析

由圖5-A可知,播種后第24天、31天、38天‘海青2號’的葉綠素指數(Chl)顯著高于‘新夏青5號’和‘紫衣’,與‘華王’相比,‘海青2號’的Chl依次增加了18.12%、45.17%、29.77%;與‘植潤988’相比,‘海青2號’的Chl依次增加了3.86%、23.78%、25.26%。由圖5-B可知,播種后第24天、31天,‘紫衣’的類黃酮指數(Flav)顯著高于其他材料,與‘華王’相比,‘紫衣’的Flav依次增加了16.43%、32.22%;與‘植潤988’相比,‘紫衣’的Flav依次增加了46.55%、44.73%;而在第38天,‘新夏青5號’的類黃酮指數(Flav)顯著高于其他材料,與‘華王’、‘植潤988’相比,‘新夏青5號’Flav依次增加了4.75%、24.17%。氮平衡指數(NBI)是評估植物氮狀態的一個標準,當未發生氮肥脅迫時,植物生長健康,合成葉綠素較多,產生的類黃酮較少;當發生氮肥脅迫時,植物營養不平衡,產生的類黃酮較多,生成葉綠素較少。由圖5-C看出,播種后第24天、31天、38天‘海青2號’的NBI均顯著高于‘新夏青5號’和‘紫衣’;在第31天、38天,與‘華王’相比,‘海青2號’的NBI依次增加了70.14%、45.24%;與‘植潤988’相比,‘海青2號’的NBI依次增加32.38%、16.24%,而在第24天,‘海青2號’的NBI比‘華王’增加了27.73%,但要低于‘植潤988’。

圖5 不結球白菜葉綠素、類黃酮、氮平衡指數分析Fig.5 Chl、Flav、Nbi of non-heading Chinese cabbage

花青素是賦予水果、蔬菜和花卉等植物顏色的主要天然色素,本研究僅在‘紫衣’中測量出花青素指數(Anth),播種后第24天、31天、38天分別為0.037 0、0.111 0、0.001 3,呈現出先增后減的趨勢,而其他材料則未測出相關數據。

3 結論與討論

光投射在物體上所留下影子的面積為投影面積,其大小受投影角度的影響[6],本試驗采用頂部投影面積對植株進行性狀分析,結果表明,‘海青2號’的緊密度最好,‘新夏青5號’的葉片面積最大,‘紫衣’是紫色的青菜,其表型特征與對照相差不大。播種后第24天時,這5個品種的相對含水量級數小,對應的相對含水量多,第31天時相對含水量下降,第38天時有所上升。通過植物多酚-葉綠素測量計Dualex Scientific+測定發現,‘海青2號’有較高的葉綠素指數和氮平衡指數,‘紫衣’有較高的類黃酮指數。

植物育種工作離不開對其表型的研究,朱紅芳等[6]通過AgriPhenoTM開放式科研平臺對紫葉紫菜薹進行表型測定,快速獲得了表型性狀優良的新組合19-520。何紅梅等[7]通過表型分析研究鐵皮石斛的表型差異,進行品種的鑒定和選擇,以促進石斛產業的發展。劉海廣等[8]通過表型分析獲得性狀優異的長白茶藨和東北茶藨,通過與栽培品種進行雜交,培育新種質。吳茜等[9]通過高通量平臺對植物根系表型進行高效采集,為篩選出具有根性狀優勢的作物奠定基礎。史吟欣等[10]通過觀測蕎麥植物表型性狀進行聚類分析,分析不同種質親緣關系。Rahaman等[11]基于高通量植物表型來模擬植物生物量的變化,該模型可以利用高通量表型圖像的非破壞性方法精確估計植物生物量,從而獲得更多的信息。植株形態、葉片大小是評價不結球白菜種植資源的重要指標,本研究發現,隨著時間的變化,5個品種間出現明顯差異,但是植株的長、寬、株高、緊密度、面積以及相對含水量的變化規律趨于一致。然而在相對含水量中研究中,播種后第38天的相對含水量要比第31天高,其變化規律對不結球白菜的生長發育有何作用還需要進一步研究。