辣椒抗逆相關轉錄因子的研究進展

張 余,章毅穎,任 麗,鄧 姍,趙 洪,褚云霞,陳海榮

(上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所,上海 201403;農業農村部植物新品種測試(上海)分中心,上海 201415;上海市設施園藝技術重點實驗室,上海 201403)

辣椒(Capsicum spp.L)為茄科辣椒屬植物,起源于中南美洲熱帶及亞熱帶地區,16世紀傳入中國。辣椒具有特殊的辛辣味,早期主要以花椒替代品出現,隨著人們對辣椒認識的深入,目前已形成了一條完整的產業鏈,覆蓋食品、醫療、工業等行業[1-2]。辣椒具有比較好的適應性,地理分布十分廣泛、品種資源多樣性非常豐富。辣椒屬有30多個種,其中,一年生辣椒(C.annuumL.)、灌木狀辣椒(C.frutescensL.)、中國辣椒(C.chinenseJacq.)、漿果狀椒(C.baccatumL.)和絨毛辣椒(C.pubescensKeep.)為5個重要的栽培種[3]。FAO(http:∕∕www.FAO.org)統計數據顯示,我國辣椒種植面積為77.16萬hm2,產量為1 821.4萬t,均居世界首位。

逆境因子分為兩類,一類為生物脅迫,另一類為非生物脅迫。辣椒生產過程中的生物脅迫因子主要包括青枯菌、疫霉菌、疫病等,非生物脅迫因子主要包括干旱、鹽漬化、高溫、低溫以及重金屬污染等。逆境條件下,植物細胞的受體蛋白感受外界刺激信號,在體內產生小分子類物質,其作為第二信使通過激酶級聯反應激活一系列轉錄因子(Transcriptionfactor,TF),促進逆境應答相關基因的表達,以增強植物對逆境的抗性[4]。目前,植物中已經發現了約64種轉錄因子家族[5]。本文主要對辣椒AP2∕ERF、WRKY、bZIP、NAC、MYB轉錄因子家族的分類以及在抗逆過程中的作用進行綜述,以期為辣椒抗逆相關分子標記的開發和抗逆育種提供參考。

1 AP2∕ERF轉錄因子家族

1.1 CaAP2∕ERF轉錄因子結構特點

AP2∕ERF轉錄因子家族因其序列含有保守的AP2∕ERF DNA結合結構域而得名,AP2∕ERF家族共分為AP2、ERF、RAV和其他(Soloist)四個亞家族,AP2亞家族含有2個AP2結構域,ERF亞族含有1個AP2結構域,RAV亞家族包含1個AP2結構域和1個B3結構域。ERF亞家族根據保守結構域中第14位和第19位的氨基酸可以進一步分為DREB和ERF亞組[6]。辣椒中存在175個AP2∕ERF轉錄因子成員,其中29個成員含有2個AP2結構域;CaAP2∕ERF152含有B3保守結構域,屬于RAV亞家族;CaAP2∕ERF140與其他ERF具有很低的同源性,歸類于Soloist亞家族;其余144個成員序列中僅包含1個AP2結構域,屬于ERF亞家族[7]。

1.2 CaAP2∕ERF轉錄因子參與辣椒抗逆

辣椒AP2∕ERF轉錄因子家族成員在植物抵抗非生物脅迫和生物脅迫過程中發揮著重要作用。CaERFLP1,ERF亞家族第IV組成員,受青枯病、高鹽、乙烯以及機械損傷誘導表達,煙草中過表達CaERFLP1基因,促進了多個與抗病相關基因的表達,這些上調表達基因的啟動子區含有AP2∕ERF家族結合的GCC-box保守元件,可進一步提高植株對假單胞桿菌和鹽脅迫的抗性[8]。Hong等[9]利用消減雜交技術從干旱脅迫后的辣椒根中分離得到了14個受干旱誘導的cDNA序列,其中CaDREBLP1編碼一個DREB亞家族轉錄因子,該轉錄因子基因的表達受干旱、高鹽誘導。CaERF4基因受茉莉酸甲酯、乙烯、青枯菌以及高溫誘導表達[10]。CaERF109基因受低溫誘導,而激素赤霉素、生長素、茉莉酸甲酯不能誘導該基因的表達[11]。CaERF5基因受水楊酸、茉莉酸甲酯、乙烯以及青枯菌誘導表達,異源表達CaERF5基因能夠促進抗病相關基因以及防御相關基因的表達,增強煙草對青枯病菌的抗性[12]。鄭井元等[13]研究發現,CaERF18基因的表達受南方根結線蟲誘導表達。表明ERF基因在應答不同逆境脅迫時存在一定的特異性。

CaAIEF1基因受干旱、高鹽、ABA誘導表達,異源表達CaAIEF1基因促進逆境相關基因的表達,正向參與干旱和ABA信號途徑[14]。辣椒受疫病侵染后CaPT1基因表達上調,VIGS(病毒誘導基因沉默)介導的基因沉默削弱了辣椒對疫病的抗性[15]。Yi等[16]研究表明,CaPF1(Capsicum annuum pathogen and freezing tolerance-related protein1)基因受乙烯、茉莉酸甲酯等激素以及鹽、低溫、甘露醇等脅迫的誘導表達,異源表達CaPF1能夠增強擬南芥對病原菌(P.syringae pv tomatoDC3000)以及凍害(-6℃)的抗性。馬鈴薯中異源表達CaPF1基因顯著提高了其對低溫、高溫、重金屬等非生物逆境因子的抗性。裸子植物弗吉尼亞松(Pinus virginianaMill.)中表達辣椒CaPF1基因增強了其對高溫、重金屬以及病原菌蘇云金芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抗性[17]。此外,過表達CaPF1基因能夠維持北美白松(Pinus strobusL.)體內的多胺水平,增強對高鹽、干旱以及凍害的耐受性。綜上,辣椒CaPF1基因通過調節植物體內的代謝過程,提高植物在不同逆境下的適應性[18]。

CaERF064受乙烯、水楊酸、茉莉酸誘導表達,瞬時表達CaERF064能夠誘導細胞發生程序性死亡,CaERF064基因的沉默抑制了抗病相關基因CaBPR1、CaPO2和CaSAR82的表達,削弱了辣椒對疫病的抗性,過表達CaERF064能夠增強煙草對疫病的抗性,表明CaERF064基因在辣椒對疫病應答方面起正調節作用[7,19]。CaRAV1包含一個AP2結構域和B3結構域,黃單孢桿菌侵染后,CaRAV1基因的表達顯著上調,擬南芥中異源表達CaRAV1提高了PR相關基因的表達,增強了對假單孢桿菌的抗性,同時轉基因過表達植株對干旱和高鹽的耐受性也顯著增強[20]。CaRAV1蛋白與氧化還原蛋白CaOXR1共定位于細胞核中,并且在體內發生互作,病毒介導CaRAV1或者CaOXR1∕CaRAV1基因的沉默顯著削弱了植株耐鹽性和滲透脅迫能力,擬南芥中過表達CaRAV1、CaOXR1和CaOXR1∕CaRAV1基因增強了植株對活體營養型卵菌的抗性和非生物脅迫的耐受性,表明辣椒通過CaOXR1∕CaRAV1信號轉導途徑實現對多種逆境的調節[21]。

2 WRKY轉錄因子家族

2.1 CaWRKY轉錄因子結構特點

WRKY轉錄因子家族保守結構域包含典型的7肽核心序列WRKYGQK,辣椒基因組中存在62個CaWRKY基因,根據WRKY結構域數目和鋅指結構的特征,WRKY轉錄因子家族分為三類:第1類由2個WRKY結構域和C2H2鋅指結構域組成,包含13個成員;第2類由1個WRKY結構域和C2H2鋅指結構域組成,包含40個成員,根據結構域保守氨基酸的差異進一步分為2a、2b、2c、2d、2e這5個亞類,分別含有4、6、16、6和8個成員;第3類由1個WRKY結構域和C2HC鋅指結構域組成,包含9個成員[22]。第二類中的2c亞組,16個成員中的13個包含完整的WRKY保守結構域,而CaWRKY1包含了1個WRKY保守結構域但缺乏鋅指motif;CaWRKY58缺乏保守的WRKY核心序列,但包含鋅指motif;CaWRKY3包含保守的WRKY結構域,但鋅指結構域不是典型的C-X4-C-X23-H-X1-H。盡管CaWRKY12含有不完整的鋅指結構,但仍然歸類為2d亞組,此外,CaWRKY 39、CaWRKY50、CaWRKY56和CaWRKY62包含非典型的WRKYGKK多肽,CaWRKY17包含WRKYGMK,CaWRKY51包含WRKYGHK多肽[23]。

2.2 CaWRKY轉錄因子參與辣椒抗逆

王倩倩等[24]研究表明,CaWRKY14基因受ABA、高溫、高鹽、干旱以及疫霉菌誘導表達,CaWRKY14基因沉默后削弱了辣椒植株對疫霉菌的抗性。CaWRKY8和CaWRKY13基因的表達受高溫和高鹽誘導表達,此外CaWRKY8還受疫霉菌及干旱誘導表達,而CaWRKY13受低溫誘導表達[25-26]。劉志欽等[27]研究發現,辣椒CaWRKY5基因啟動子-886—489位置存在應答青枯菌侵染的作用元件。CaWRKY2受辣椒輕斑駁病毒、黃單胞菌、ETH、SA、MeJA和機械損傷誘導表達[28]。辣椒青枯菌、疫病、煙草花葉病毒均能夠誘導CaWRKY30基因的表達,有毒性的根結線蟲侵染和MeJA處理后CaWRKY30基因表達受到了明顯抑制[29]。

干旱和高鹽脅迫條件下,異源表達CaWRKY27基因導致了體內ABA合成、ROS解毒以及多胺合成相關基因下調表達,植株的抗逆性減弱,而CaWRKY27基因的沉默植株則表現出相反的結果[30]。外源SA、ETH、MeJA以及青枯菌能夠誘導CaWRKY27基因的表達,煙草中異源表達CaWRKY27基因顯著提高了其對青枯菌的抗性,沉默該基因則表現出相反的表型[31]。過表達CaWRKY20基因促進抗逆相關基因CaNPR1、CaDEF1、CaACO、CaHsfA2和CaHSP24的表達,沉默CaWRKY20基因,辣椒植株對青枯病的抗性顯著降低,異源表達CaWRKY20基因,煙草對青枯病的抗性顯著提高[32]。CaWRKY58編碼一個I型WRKY轉錄因子,在辣椒調節青枯菌侵染過程中發揮負向作用[33]。

CaWRKY40基因的表達受JA、SA、ETH、高溫高濕和青枯菌的誘導,異源表達CaWRKY40基因顯著提高煙草對青枯菌以及高溫的耐受性,而辣椒CaWRKY40基因的沉默削弱了植株對青枯菌以及高溫的抗性[34]。CaWRKY22基因的表達受多種激素以及青枯菌的誘導,直接參與CaPR1、CaDEF1、CaWRKY40等基因的調節,與CaWRKY40之間表現出反饋調節關系,此外,CaWRKY22還與CaWRKY6、CaWRKY27和CaWRKY58存在復雜的調控關系[35]。CaWRKY6基因的表達受高溫、高濕、青枯菌、JA、ETH以及ABA的誘導表達,能夠結合CaWRKY40基因啟動子區的W-box(TTGACCY)元件[36]。何水林等[36-37]通過對CaWRKY40轉錄因子作用的靶基因進行篩選,獲得了一批直接受CaWRKY40調節的基因,如CaC3H14、CaHIR1、CaPO2、CaDEF1、CabZIP53等,由此推斷辣椒CaWRKY40基因在調節青枯菌侵染的信號途徑方面發揮關鍵作用。CaWRKY71與CaWRKY40二者相互作用,沉默CaWRKY71基因導致抗病相關基因CaPR1、CaNPR1、CaDEF1、CaABR1等表達下調,增強了辣椒對青枯菌的敏感性[38]。CaWRKY3基因在應答青枯菌侵染過程中起負調節作用[39]。黃雪盈等[40]研究發現,CaWRKY40b與CaWRKY40同源,青枯菌侵染后其表達水平發生顯著下調,CaWRKY40b基因沉默植株對青枯菌的抗性顯著減弱;過表達CaWRKY40b-SRDX后(SRDX起嵌合阻遏作用)表現出相同的結果[41]。此外,CaWRKY40與CaCDPK15在轉錄水平上反饋調節辣椒對青枯菌的抗性[42]。根結線蟲是辣椒的主要病害之一,目前辣椒生產中根結線蟲抗性品種相對較少,鄭井元[43]通過轉錄組數據獲得了2個應答根結線蟲入侵的WRKY基因CaWRKY6和CaWRKY30,轉基因試驗證明CaWRKY30基因在應答根結線蟲入侵過程中起負向調節作用,而CaWRKY6在應答根結線蟲入侵中的作用不顯著。

3 bZIP轉錄因子家族

3.1 CabZIP轉錄因子結構特點

bZIP轉錄因子是由其保守的堿性亮氨酸拉鏈結構域來命名,核心保守結構域由基本區(basic region)和ZIP區組成,其中基本區含有結合DNA的N-x7-R∕K以及一個NLS(核定位信號),ZIP區由亮氨酸的七肽重復結構(L-X6-L-X6)組成。bZIP轉錄因子家族可以結合A-box(TACGTA)、T-box(AACGTT)、C-box(GACGTC)、G-box(CACGTG)以及Gcn4(G∕CTCA)順式作用元件。魏瑞敏等[44]將辣椒bZIP分為10個組,分布于辣椒11條染色體,含54個基因,分別具有0—11個內含子。Gai等[45]在辣椒品種‘Zunla-1’和‘CM334’中分別篩選到了59個、55個完整的bZIP基因。

3.2 CabZIP轉錄因子參與辣椒抗逆

在干旱脅迫或者外源ABA處理條件下,馬鈴薯中異源表達辣椒bZIP轉錄因子CaBZ1基因,可促進植株體內抗逆相關基因CYP707A1、CBF、NAC-like的表達,導致氣孔導度、葉片失水速率、葉綠素含量顯著降低,產量顯著增加[46]。煙草中瞬時表達CabZIP1,可通過結合CaPR-1基因啟動子區的G-box促進PR-1基因表達,參與辣椒抗病相關途徑的調節[47]。CaDILZ1(Capsicum annuum Drought-Induced Leucine Zipper1),屬于bZIP家族D組成員,該基因的表達受ABA、干旱、高鹽誘導,與CaDSR1調控網絡共同參與辣椒抗旱過程[48]。CaASRF(Capsicum annuum ABA Sensitive RING Finger E3ligase1),編碼一個泛素連接酶,通過調節bZIP轉錄因子CaAIBZ1和CaAIBZ1的穩定性正向調節植物的抗旱性,表明這兩個CabZIPs轉錄因子在調節植物抗旱過程中發揮負調節作用[49-51]。

煙草中異源表達CabZIP1可以提高煙草耐鹽能力,但對青枯菌表現敏感,辣椒中CabZIP1基因的沉默導致植株對鹽脅迫的敏感性增強而對青枯菌的抗性顯著增強,此外過表達植株對ABA的敏感性顯著減弱[52]。CabZIP53為CaWRKY40轉錄因子的靶蛋白,青枯菌侵染誘導CabZIP53基因的表達,VIGS介導的CabZIP53基因沉默植株在青枯菌侵染后,其體內CaPR1、CaNPR1和CaHIR1等抗病相關基因發生下調,削弱了辣椒對青枯菌的抗性[53]。青枯菌和高溫高濕環境能夠誘導CabZIP63基因的表達,該基因通過結合自身以及CaWRKY40啟動子區的C-box或者G-box參與調節其表達水平,沉默CabZIP63基因導致免疫以及高溫相關基因的表達發生下調[54]。

Lee等[55]從黃單胞桿菌侵染后的辣椒材料中克隆了一個bZIP轉錄因子CAbZIP1基因,異源表達該基因顯著提高了擬南芥抵抗丁香假單胞菌(Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000)侵染能力,同時增強了植株抗旱、耐鹽以及抗氧化的能力。VIGS介導的CabZIP2基因沉默降低了與防御相關的基因CaBPR1和CaAMP1的表達,增強了植株對黃單孢桿菌的敏感性,而過表達植株則表現出相反的表型[56]。Lee等[57]分離出辣椒輕斑駁病毒相關基因PPI1(pepper-PMMV interaction1),該基因屬于bZIP轉錄因子家族成員,其表達受不親和輕斑駁病毒及黃單孢桿菌誘導,非生物脅迫SA、MeJA、ABA和H2O2不影響其表達,暗示著PPI1基因僅在防御方面發揮作用。

4 NAC轉錄因子家族

4.1 CaNAC轉錄因子結構特點及分類

NAC轉錄因子家族為植物所特有,該轉錄因子家族序列的N端包含一個高度保守的DNA結合結構域和C端可變的激活結構域,N端結構域進一步可以分為5個亞結構域,根據結構域和亞結構域,NAC轉錄因子家族被分為兩組,I組和II組,這兩組可以進一步分為14個和4個亞組[58]。Diao等[59]通過全基因組測序發現104個NAC轉錄因子,這些轉錄因子主要集中在1、2、4、6號染色體上,共分為3組:I組中含有63個成員;II組中含10個成員;III組為茄科所特有,含有24個成員。CaNACs擁有0—8個內含子,其中含2個以內的內含子數量的轉錄因子占到了78.9%(為83個)。

4.2 CaNAC轉錄因子參與辣椒抗逆

目前關于辣椒NAC轉錄因子在抗逆方面的研究較少,CaNAC45基因的表達受干旱、高鹽、ABA、SA、MeJA脅迫誘導[60]。Oh等[61]發現,CaNAC1通過不兼容的過敏性細胞壞死來提高植物對非寄主病原菌和病毒的防御反應。刁衛平等[62]通過轉錄組鑒定到了21個應答疫霉菌侵染的NAC轉錄因子基因,其中18個屬于Group1、3個屬于Group2,暗示NACs參與辣椒對疫霉菌侵染的應答。

CaNAC72基因的表達受多種植物激素、非生物逆境以及青枯菌的誘導表達,煙草中異源表達CaNAC72基因顯著提高了植株對鹽脅迫的抗性,但對青枯菌的抗性顯著下降,暗示CaNAC72在參與調節逆境方面發揮雙重作用[63]。CaNAC35基因的表達受多種非生物逆境因子以及激素的誘導表達,CaNAC35基因沉默的植株在低溫、高鹽和滲透脅迫下抗性顯著降低,過表達轉基因植株則表現出相反的表型[64]。CaNAC2基因受低溫、高鹽、ABA誘導,此外滲透脅迫和水楊酸抑制了CaNAC2的表達,基因沉默增強了其對冷脅迫的敏感性,但延緩了鹽脅迫下葉綠素的降解[65]。CaNAC36基因受乙烯、茉莉酸甲酯誘導表達,甘露醇、高鹽以及水楊酸能夠抑制其表達;煙草中表達CaNAC36顯著削弱了其對青枯菌以及鹽分的抗性[66]。Hou等[67]研究表明,CaNAC064基因正向調節辣椒對低溫的抗性。NAC轉錄因子CaBtf3(B transcription factor3)基因抑制了HR反應相關基因的表達,導致對Tobacco mosaic virus(TMV)-P0病原菌的抗性減弱,煙草中沉默CaBtf3的同源基因NtBtf3表現出相似的結果[68]。

5 MYB轉錄因子家族

5.1 CaMYB轉錄因子結構特點

MYB轉錄因子序列中均含有一個高度保守的MYB保守結構域,該結構域通常由0—4個不完全氨基酸序列重復(R)組成,每個重復區(R)包含約52個氨基酸,根據重復區(R)的數量,擬南芥中的MYB轉錄因子家族分為1R、2R、3R、4R共4個亞組[69]。居利香等[70]利用生物信息學方法從辣椒基因組中篩選到172個MYB轉錄因子,1R、2R、3R、4R亞組中分別含有61、105、5個和0個,此外,6R亞組為辣椒所特有。轉錄因子基因分布于辣椒的12條染色體上,絕大部分分布于染色體的末端,尚有14個MYB基因的染色體定位信息不清楚。此外,MYB基因含有0—5個內含子,其中含有2個內含子的基因數目占比47%。

5.2 CaMYB轉錄因子參與辣椒抗逆

MYB轉錄因子家族基因在花青素、果實生長發育、品質等方面的調控作用比較多,而花青素與植物的品質和抗逆性密切相關[71]。辣椒R2R3類型的轉錄因子CaMYB基因受多種脅迫處理表達,如高鹽、低溫、干旱、ABA等[72]。CaPHL8基因沉默后,與防御相關的標記基因的轉錄水平降低,植株對青枯菌的免疫力降低,生長受到抑制,表明CaPHL8基因正向調節辣椒對青枯菌的抗性[73]。Mishra等[74]發現1個MYB轉錄因子基因CaMYB在高抗材料中的表達水平極顯著高于敏感材料。以上結果均表明,辣椒MYB轉錄因子家族在應答逆境脅迫方面也發揮著重要作用。

6 展望

轉錄因子家族基因在不同植物中往往在功能上存在相關性,如擬南芥和水稻中bZIP轉錄因子家族中的A組成員參與ABA信號途徑,調節氣孔開閉以及種子萌發等過程,辣椒bZIP轉錄因子家族中的A組成員可能也具有相似的功能。不同轉錄因子(家族)在同一脅迫下可能發揮相同作用,這些轉錄因子間的調控存在著復雜的交叉作用,如Hwang等[75]從辣椒中分離出317個受冷脅迫相關的基因,包括AP2∕ERF、WRKY、bZIP等轉錄因子家族的基因。申磊[76]通過ChIP試驗揭示了CabZIP63能夠結合CaWRKY40基因的啟動子區,參與CaWRKY40應答的青枯菌以及高溫途徑;CabZIP、CaMYB、CaWRKY等基因同時參與對炭疽病的應答;AP2轉錄因子CaPF1參與凍害和病原菌脅迫途徑[16-18,74]。此外,茄科或者辣椒所特有的轉錄因子參與的調控途徑可能為種屬所特有[77-78]。

盡管辣椒中多個轉錄因子被鑒定,然而大多數僅在表達層面作出了分析,關于轉錄因子在逆境中的功能研究相對有限,近年來植物轉基因技術發展非常迅速,研究者們對辣椒的遺傳轉化也做了非常多的探索性工作,成功誘導出愈傷組織并分化出葉片,但很少能分化出根,這在很大程度上限制了辣椒基因功能的研究與利用。未來突破辣椒轉基因技術以及抗逆相關基因的挖掘和鑒定,對于改良辣椒品種、培育抗逆性強的辣椒品種具有重要意義。