利用花藥培養(yǎng)和分子標(biāo)記輔助相結(jié)合方法選育香軟型粳稻新品種

黃衛(wèi)峰,閆 影,王 凱,張麗霞,胡澤軍,吳書俊*

(1上海市崇明區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,上海 202150;2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所∕上海農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工工程技術(shù)研究中心,上海 201403)

水稻是我國主要的糧食作物之一,我國有60%以上人口以稻米為主食。過去20年來,隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的快速發(fā)展,人民生活水平逐漸提高,雖然我國人均稻米消費(fèi)量不斷下降,但粳米的人均消費(fèi)量卻增加了40%,同時(shí)消費(fèi)者對稻米食味品質(zhì)的要求也越來越高,市場對高品質(zhì)優(yōu)質(zhì)粳米的消費(fèi)需求日益突出[1]。為滿足稻米產(chǎn)業(yè)和消費(fèi)市場的需求,選育優(yōu)良食味粳稻新品種已成為當(dāng)前粳稻育種工作的重點(diǎn)。

長三角地區(qū)居民歷來喜歡食用香味濃郁、口感柔軟的粳米。香味是稻米的重要品質(zhì)特征之一,研究表明,水稻香味受到BADH2基因控制,該基因編碼一個(gè)甜菜堿醛脫氫酶,能夠分解香稻香氣主要成分2-乙酰基-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2AP)的前體物質(zhì)。在不同的香稻品種中,BADH2基因結(jié)構(gòu)發(fā)生變異,編碼酶的功能缺失,導(dǎo)致2AP前體物質(zhì)增加,從而累積2AP,使稻米產(chǎn)生香味[2]。目前,在基因BADH2中至少存在17個(gè)變異位點(diǎn),其中第7外顯子8 bp缺失及3 bp突變和第2外顯子7 bp缺失是香稻資源中中較為常見的2個(gè)變異位點(diǎn)[3]。利用這些變異位點(diǎn)的功能標(biāo)記進(jìn)行分子育種已成為香稻育種工作中的重要技術(shù)手段,吳書俊等[4]借助分子標(biāo)記輔助選擇定向聚合抗條紋葉枯病基因Stv-bi和香味基因badh2-E2,選育出優(yōu)質(zhì)、抗條紋葉枯病的高產(chǎn)香粳品種‘滬香粳106’。稻米的食味品質(zhì)性狀屬于復(fù)雜的綜合數(shù)量性狀,其中直鏈淀粉含量是影響稻米食味的主要因素之一。直鏈淀粉含量受Wx基因編碼的顆粒結(jié)合淀粉合成酶GBSSⅠ(Granule bound starch synthesisⅠ)調(diào)控,Wx基因存在多個(gè)復(fù)等位變異,包括Wxa、Wxb、Wxop∕hp、Wxlv、Wxmw、Wxmp、Wxin和wx等,這些變異導(dǎo)致稻米胚乳中直鏈淀粉含量的差異[5]。其中Wxmp在編碼區(qū)第497位有一個(gè)G∕A的SNP,影響Wx蛋白活性,進(jìn)而造成直鏈淀粉含量降低,該基因在軟型粳米品種選育中應(yīng)用廣泛,國內(nèi)育種家利用該基因育成多個(gè)低直鏈淀粉含量的優(yōu)質(zhì)稻品種,如‘南粳46’‘滬軟1212’等。

稻瘟病是由子囊真菌(Magnaportheoryzae)引起的一種危害嚴(yán)重的水稻真菌病害,是水稻世界性三大病害之一。近年來我國稻瘟病年均發(fā)生面積約為4.7×1010m2,2013年以后發(fā)病情況更呈現(xiàn)上升趨勢。實(shí)踐證明,選育推廣具持久和廣譜抗性的水稻新品種是防治稻瘟病最有效的方法,當(dāng)前全國各地在新品種審定時(shí)都已實(shí)施對稻瘟病表現(xiàn)感病的“一票否決制”[6-7]。截至目前,已鑒定抗稻瘟病質(zhì)量性狀基因100多個(gè),數(shù)量性狀位點(diǎn)500多個(gè)。研究表明,抗病基因Pita、Pi5、Pi2、Pikm和Pigm在長三角地區(qū)對稻瘟病表現(xiàn)出廣譜高效抗性,在抗稻瘟病粳稻育種中具有重要應(yīng)用價(jià)值[8-9]。

花藥培養(yǎng)是一種雙單倍體(DH)育種方法,利用該技術(shù)可以快速獲得純合二倍體,具有選擇效率高、育種周期短等優(yōu)點(diǎn)。近年來花藥培養(yǎng)技術(shù)在水稻育種中得到廣泛應(yīng)用,余波等[10]利用花藥培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)中美水稻親本之間有利性狀的互補(bǔ),獲得改良型中國水稻新種質(zhì)18份、改良型美國水稻新種質(zhì)6份。本研究以優(yōu)質(zhì)粳稻新品系滬香軟16-18為母本,抗稻瘟病粳稻新品系滬香粳16-44為父本進(jìn)行雜交配組,利用花藥培養(yǎng)技術(shù)、分子標(biāo)記輔助技術(shù)和常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合的育種策略,快速實(shí)現(xiàn)多個(gè)目標(biāo)基因聚合,育成抗稻瘟病香型優(yōu)質(zhì)食味米新品種‘崇尚2022’,為高效選育香軟型優(yōu)質(zhì)粳稻新品種提供成功的育種實(shí)踐。

1 材料與方法

1.1 供試材料與選育經(jīng)過

滬香軟16-18是上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所水稻中心以太湖香粳∕南粳46雜交選育而成的優(yōu)質(zhì)粳稻新品系,具有香味、低直鏈淀粉含量、食味品質(zhì)優(yōu)良的特點(diǎn);滬香粳16-44是該團(tuán)隊(duì)以南粳46∕武香粳19雜交選育而成的優(yōu)質(zhì)粳稻新品系,具有香味,并且稻瘟病抗性綜合指數(shù)在5級(jí)以下。

2016年冬,在上海南繁育種基地開始以香軟型粳稻新品系滬香軟16-18為母本,以香型抗稻瘟病粳稻新品系滬香粳16-44為父本進(jìn)行雜交配組,并收獲F1雜交種子;2017年夏,在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗(yàn)站種植F1代植株,當(dāng)F1代植株處于孕穗打苞階段時(shí),剝?nèi)∮姿脒M(jìn)行花藥離體培養(yǎng)后得到花培幼苗;2017年冬,種植花培第一代植株并收獲種子,于2018年夏季種植形成82個(gè)遺傳穩(wěn)定的DH姊妹株系;經(jīng)過2019—2020年連續(xù)兩年綜合性狀的鑒定,于2020年在10個(gè)DH姊妹系中選擇最優(yōu)1個(gè)香軟型純合株系,并命名為‘崇尚2022’(圖1)。

圖1 ‘崇尚2022’的選育過程Fig.1 Breeding process of‘Chongshang2022’

1.2 目標(biāo)基因檢測

在水稻移栽成活后采集幼嫩葉片,采用CTAB法提取水稻全基因組DNA[11]。利用Bradbury等[12]根據(jù)Badh2基因編碼區(qū)第7外顯子8 bp缺失和3 bp變異設(shè)計(jì)的功能標(biāo)記區(qū)分香稻和非香稻品種;利用陳濤等[13]根據(jù)基因Wxmp由Wx位點(diǎn)第497位核苷酸G∕A的等位變異設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增后測序區(qū)分Wx是否Wxmp變異;利用王忠華[14]根據(jù)Pita基因抗感序列差異設(shè)計(jì)的功能標(biāo)記檢測抗稻瘟病基因Pita(表1)。

表1 目標(biāo)基因及其共分離分子標(biāo)記信息Table 1 Target genes and theirco-segregatedof molecular markers

PCR擴(kuò)增體系20μL,包含DNA模版2μL,2×Hieff PCR Master Mix(With Dye)10μL,引物等體積混合液1.6μL,ddH2O 6.4μL。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,所用試劑購自上海翊圣生物科技有限公司。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55—57℃退火30 s,72℃復(fù)性30 s,共33個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,10℃保存。除引物Wx-mp-O-F和Wx-mp-O-R擴(kuò)增產(chǎn)物需要測序以外,其余產(chǎn)物經(jīng)含有核酸染料的2%瓊脂糖凝膠電泳分離,在紫外凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察多態(tài)性差異。

1.3 水稻香味鑒定

分別采用氫氧化鉀(KOH)法和咀嚼法鑒定水稻葉片香味和米粒香味[15]。

1.4 稻米直鏈淀粉含量測定

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB∕T 15683—2008《大米直鏈淀粉含量的測定》方法測定直鏈淀粉含量,每個(gè)樣品重復(fù)測定2次,取平均值。

1.5 稻瘟病抗性鑒定

用于稻瘟病抗性鑒定的供試菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供,每一年的孢子混合液為上一年度江蘇省及周邊地區(qū)稻瘟病優(yōu)勢生理小種混合菌液。在水稻孕穗初期,向幼穗穗苞內(nèi)注射接種稻瘟病菌菌株孢子混合液,每株選1個(gè)穗苞注射1 mL,每個(gè)株系注射10株。在水稻成熟期,按國家標(biāo)準(zhǔn)GB∕T 15790—2009《稻瘟病測報(bào)調(diào)查規(guī)范》調(diào)查水稻穗頸瘟的發(fā)病情況,分級(jí)記載。

1.6 花藥培養(yǎng)方法

在孕穗期,選擇長勢健壯、無病斑的植株,取處于單核靠邊期、葉枕距為5—7 cm的水稻幼穗,保留劍葉,用75%酒精表面消毒,并用濕紗布包裹,然后用保鮮膜包裹,置于8℃低溫預(yù)處理12 d。在無菌臺(tái)上選取合適的幼穗剝開,用1%的次氯酸鈉溶液消毒30 min,滅菌水洗8次,取出花藥,接種于YD2培養(yǎng)基,26—27℃,暗培養(yǎng)(約30—40 d)。待愈傷組織長至2 mm時(shí),轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基FH4,暗培養(yǎng)2 d,后光照培養(yǎng),溫度26—27℃。

YD2培養(yǎng)基:N6培養(yǎng)基+植物凝膠3.5 g∕L+蔗糖50 g∕L+2,4-D 2.0 mg∕L+NAA 1.0 mg∕L+KT 1.0 mg∕L+水解酪蛋白0.5 g∕L,調(diào)pH為5.8。

FH4培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+植物凝膠3.5 g∕L或瓊脂6 g∕L+蔗糖30 g∕L+NAA 0.5 mg∕L+6-BA 2.0 mg∕L+MET 2.5 mg∕L+水解酪蛋白0.5 g∕L,調(diào)pH為5.8。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本基因型鑒定

分別利用香味等位基因badh2-E7、低直鏈淀粉含量基因Wxmp以及抗稻瘟病基因Pita的功能標(biāo)記對親本滬香軟16-18和滬香粳16-44進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,滬香軟16-18攜帶基因badh2-E7和Wxmp,而不攜帶Pita;滬香粳16-44攜帶Pita,而不攜帶badh2-E7和Wxmp(圖2)。滬香粳16-44的香味是由Badh2基因第2外顯子變異所導(dǎo)致。

圖2 親本中香味等位基因badh2-E7(A)、低直鏈淀粉含量基因Wxmp(B)和抗稻瘟病基因Pita(C)的分子標(biāo)記檢測結(jié)果Fig.2 Genotypedection of badh2-E7(A),Wxmp(B)and Pita(C)in parent materials

2.2 F1花藥培養(yǎng)株系的獲得

2017年春季,在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院南繁基地將滬香軟16-18和滬香粳16-44雜交,夏季在上海種植F1,取幼穗開展花藥培養(yǎng),共接種2 050枚花藥,獲得胚狀體262個(gè),誘導(dǎo)率12.8%,成苗168株,成苗率64.1%,誘導(dǎo)、分化及幼苗表現(xiàn)良好(圖3)。2017年冬季,在海南種植168個(gè)花培H0代植株,2018年夏季,在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗(yàn)站種植篩選出的82個(gè)花培H1代株系。

圖3 花藥培養(yǎng)Fig.3 Anther culture

2.3 花藥培養(yǎng)株系的基因檢測

分別利用基因badh2-E7、Wxmp和Pita的功能標(biāo)記對82個(gè)株系進(jìn)行檢測,其中23個(gè)株系攜帶香味等位基因badh2-E7,35個(gè)株系攜帶低直鏈淀粉含量基因Wxmp,53個(gè)株系攜帶抗稻瘟病基因Pita(表2)。其中有10個(gè)株系含有全部3個(gè)基因。

表2 82個(gè)株系基因檢測結(jié)果Table 2 The results of molecular detection in 82 lines

2.4 花藥培養(yǎng)株系的香味、直鏈淀粉含量及稻瘟病抗性綜合鑒定

利用氫氧化鉀(KOH)法鑒定同時(shí)攜帶基因badh2-E7、Wxmp和Pita的10個(gè)DH株系葉片香味,同時(shí)開展直鏈淀粉含量測定和田間稻瘟病抗性鑒定,結(jié)合田間農(nóng)藝性狀、抗性接種鑒定結(jié)果和食味口感水平選出最優(yōu)株系DH48,命名‘崇尚2022’。

2.5 ‘崇尚2022’農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量水平

‘崇尚2022’在上海地區(qū)作移栽稻全生育期145 d左右,一般在10月上中旬成熟;株高90 cm左右,每667 m2有效穗數(shù)21萬—23萬,每穗總粒數(shù)120—130粒,結(jié)實(shí)率92%—95%,千粒重26—27 g。2020年開始參加上海市區(qū)試,667 m2平均產(chǎn)量620.2 kg,2021年區(qū)試667 m2平均產(chǎn)量677.9 kg,2021年生產(chǎn)試驗(yàn)667 m2平均產(chǎn)量644.3 kg。‘崇尚2022’整個(gè)生育期長勢旺盛,株型緊湊,葉片挺直,分蘗力中等,田間調(diào)查表現(xiàn)株高矮、抗倒性強(qiáng);田間表現(xiàn)對稻瘟病抗性較好,含抗稻瘟病廣譜高效基因Pita(圖4C)。2021年經(jīng)江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所進(jìn)行抗病性鑒定,稻瘟病綜合抗病指數(shù)為4.7(中感)。

表3 香味、直鏈淀粉含量和稻瘟病抗性評價(jià)結(jié)果Table 3 Evaluation of fragrance,amylose content and blast resisitence

2.6 ‘崇尚2022’稻米品質(zhì)

‘崇尚2022’具有明顯香味,含有香味基因badh2-E7,其來源于香型親本滬香軟16-18(圖4A)。‘崇尚2022’口感柔軟有彈性,含有低直鏈淀粉含量基因Wxmp,其來源于親本滬香軟16-18(圖4B)。經(jīng)檢測,‘崇尚2022’直鏈淀粉含量一般在9.5%—12.7%,當(dāng)水分含量保持在15.0%以上時(shí)大米外觀透明度較好。2020—2021年的品質(zhì)檢測結(jié)果表明(表4),除遺傳因素導(dǎo)致的低直鏈淀粉含量以外,其余品質(zhì)指標(biāo)都在優(yōu)質(zhì)米三等以上,其中整精米率、堊白度、膠稠度等主要加工、外觀和食味指標(biāo)兩年均在二等以上。2019—2020年在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所稻米品質(zhì)分析實(shí)驗(yàn)室對其品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行檢測,直鏈淀粉含量分別為11.0%、11.2%,膠稠度分別為86.5 mm、86.0 mm,蛋白質(zhì)含量分別為8.5%、9.5%,米飯食味值分別為81分和84分。

圖4 ‘崇尚2022’香味等位基因badh2-E7(A)、低直鏈淀粉含量基因Wxmp(B)和抗稻瘟病基因Pita(C)的分子標(biāo)記檢測結(jié)果Fig.4 Genotypedection of badh2-E7(A),Wxmp(B)and Pita(C)in‘Chongshang2022’

表4 2020—2021年度‘崇尚2022’稻米品質(zhì)檢測結(jié)果Table 4 The test for rice quality of‘Chongshang2022’in 2020 and 2021

3 結(jié)論與討論

優(yōu)良單株選擇是水稻育種的重要環(huán)節(jié),傳統(tǒng)的育種方式存在表型鑒定難、育種周期長、工作量大、效率低等問題,而且還容易受到環(huán)境影響,鑒定結(jié)果表現(xiàn)不穩(wěn)定。利用花藥培養(yǎng)和分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的技術(shù)進(jìn)行水稻育種,可快速獲得目標(biāo)性狀穩(wěn)定遺傳的株系,有效縮短育種年限,減少表型鑒定的工作量和難度。同時(shí),通過花藥培養(yǎng)建立起來的DH群體可以快速形成長久穩(wěn)定遺傳的種質(zhì)資源,適宜在育種中廣泛應(yīng)用。當(dāng)前,利用花藥培養(yǎng)和分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的技術(shù)開展水稻育種的研究多有報(bào)道。徐華山等[16]利用花藥培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合香味基因fgr的檢測,快速創(chuàng)制長粒型優(yōu)質(zhì)秈稻材料‘潤香玉’;査中萍等[17]利用花藥培養(yǎng)結(jié)合廣親和基因S5n的分子標(biāo)記輔助選擇,快速選育廣親和材料。

當(dāng)前上海主栽優(yōu)良食味米品種多為熟期偏遲、株高偏高的軟型粳稻品種,對稻瘟病抗性、倒伏抗性普遍偏弱。提高軟型優(yōu)質(zhì)粳稻品種的稻瘟病抗性和倒伏抗性已經(jīng)成為當(dāng)前上海優(yōu)質(zhì)稻米產(chǎn)業(yè)綠色健康發(fā)展亟需解決的瓶頸問題。本研究利用花藥培養(yǎng)和分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的技術(shù)高效選育出攜帶香味基因badh2-E7、低直鏈淀粉含量基因Wxmp和抗稻瘟病基因Pita,同時(shí)株高在90 cm左右的香軟型優(yōu)質(zhì)粳稻新品種‘崇尚2022’,并于2022年10月通過上海市農(nóng)作物品種審定(審定編號(hào):滬審稻2022007)。該品種表現(xiàn)田間抗倒性強(qiáng),稻瘟病抗性好,生態(tài)適應(yīng)性廣,稻米香味濃,米飯食味口感好。相較于上海當(dāng)前主栽的優(yōu)良食味米品種,‘崇尚2022’稻瘟病抗性和抗倒伏性均有了顯著提高,同時(shí)生育期變短,對于適時(shí)收獲并對綠肥等冬季作物適時(shí)播種具有積極作用。