綠豆對尾孢菌葉斑病的生理生化響應及病害早期檢測

李靈慧,吳然然,陳景斌,崔曉艷,袁星星,朱月林,陳 新*

(1江蘇省農業科學院經濟作物研究所,南京 210014;2南京農業大學園藝學院,南京 210095)

綠豆[Vigna radiate(L.)Wilczek]屬于豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionaceae)豇豆屬(Vigna),是亞洲乃至全球農業系統中重要的雜糧作物[1-2]。近年來,隨著農業供給側結構性改革的推進,綠豆種植面積逐漸增加,但其單產水平一直較低[3],其中病害是導致綠豆減產的主要因素之一[4]。葉斑病是綠豆生產中最常見和危害最為嚴重的葉部真菌病害[5],由尾孢菌的多個種引起[6],其中變灰尾孢菌(Cercospora canescensEll.et Martin)是最主要的病原菌[7-8],發病時可導致綠豆減產50%以上。

病原菌侵染植物后,植物體內往往發生一系列的生理變化[9-10]。通過研究病害發生后植物生理指標的變化,有利于全面了解植物抵御病害的作用機理[11]。葉綠素是最主要的植物光合色素,與植物的生長發育及病害脅迫等密切相關[12-13],SPAD值與葉綠素含量成正相關。丙二醛(MDA)可以與細胞內多種物質反應,引起細胞中核酸、蛋白質、膜脂分子的破壞,是膜脂過氧化程度的重要指標[14]。抗氧化防御酶被認為是脅迫下植物重要的防御體系,可以清除活性氧,保證植株正常生長[15];超氧化物歧化酶(SOD)的作用是清除和減少體內的破壞性氧自由基[16],過氧化物酶(POD)可以反映出植株的生長及代謝狀況[17]。葉綠素熒光成像系統由于具有測定快速、無損的特點,在植物的生物脅迫研究中存在巨大潛力,葉綠素熒光參數可以靈敏探測植物光合生理狀況[18],而葉綠素熒光參數圖像則可以直觀顯示病害感染情況[19]。

目前,綠豆葉斑病的生理指標研究相對較少。本研究以綠豆葉斑病的抗病品種‘V4718’和感病品種‘V1197’為試驗材料,分析葉片接種變灰尾孢菌后其抗氧化防御酶活性、丙二醛含量、葉綠素含量、葉綠素熒光參數的響應差異,同時針對感染早期綠豆葉片和健康綠豆葉片的葉綠素熒光參數通過算法模型進行分類判別,以期為探索綠豆葉斑病的生理機制和病害檢測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與菌株

供試材料為綠豆葉斑病抗病品種‘V4718’(來源:印度)和感病品種‘V1197’(來源:巴基斯坦),由江蘇省農業科學院經濟作物研究所提供。

供試菌株為變灰尾孢菌,由江蘇省農業科學院經濟作物研究所分離保存。

1.2 葉斑病接種方法及取樣

試驗于2020年8—12月在江蘇省農業科學院經濟作物研究所實驗室溫室內進行,綠豆于小型圓形塑料花盆中種植,完全隨機排布。待綠豆植株第一組復葉展開后,選擇長勢一致的健康植株的葉片進行菌絲塊刺傷接種,具體操作為在綠豆葉片的中央且偏離葉脈的位置用無菌牙簽造成微傷口,于V8培養基上28℃培養7 d左右的變灰尾孢菌邊緣部分取菌絲塊,將菌絲一面貼于傷口處,同時以不接種變灰尾孢菌的綠豆為對照。將接種及對照綠豆植株放入保濕棚25 °C保濕36 h,之后在25 °C、相對濕度60%左右條件下正常生長,分別在接種后1 d、2 d、4 d、6 d取樣,調查相關指標。

1.3 測定項目及方法

使用SPAD-502 plus型葉綠素儀測定綠豆葉片葉綠素相對含量(SPAD值);使用硫代巴比妥酸比色法測定綠豆葉片的丙二醛含量,具體參照趙世杰等[20]方法;綠豆葉片的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)測定選擇北京索萊寶科技有限公司生產的酶活測定試劑盒(BC0170-50管∕24樣、BC0090-50管∕48樣);綠豆葉片葉綠素熒光參數的測定選用FluorCam FC800葉綠素熒光成像系統,測定前葉片需暗處理30 min,每個處理3次重復,取平均值。

用MATLAB 2019a軟件構建綠豆葉斑病機器學習算法模型,分別采用決策樹(decision tree,DT)、K近鄰法(k nearest neighbor,KNN)、支持向量機(support vector machine,SVM)3種算法模型,以葉片的全部葉綠素熒光參數經主成分降維后的數據為輸入,驗證方法選擇5-折交叉驗證。本試驗主要檢測在綠豆葉片未形成明顯可見病斑時相關數據,即接種后1 d、2 d、3 d的綠豆葉片各150片及正常未接種葉片100片的葉綠素熒光數據。興趣區域(ROI)選擇與數據導出利用FluorCam 7軟件完成。

1.4 數據處理

采用Excel 2019及SPSS 22.0軟件對試驗數據進行處理,顯著性分析采用Duncan’s法(P＜0.05)。采用Photoshop 2019、Powerpiont 2019和GraphPad Prism 5軟件作圖,算法模型判別處理采用MATLAB 2019a軟件。

2 結果與分析

2.1 葉斑病對綠豆葉片葉綠素和丙二醛含量的影響

由圖1可知,兩個綠豆品種葉片的葉綠素含量均隨著感染時間的增加逐漸下降,‘V1197’與‘V4718’的葉綠素含量在第4天和第6天分別比未接種處理下降19.95%、41.40%和11.90%、17.74%,且在接種后第4天和第6天感病品種的SPAD值顯著低于抗病品種,表明感病品種的葉片葉綠素分子損失和破壞較嚴重。

圖1 綠豆抗病品種和感病品種葉片的葉綠素含量變化Fig.1 Changes of chlorophyll relative content in leaves of resistant and the susceptible mungbean cultivars

如圖2所示,隨著接種時間的延長,‘V1197’葉片的MDA含量在接種后第4天和第6天明顯升高,分別高出未接種處理164.14%、241.63%;而‘V4718’葉片的MDA含量在接種后第4天和第6天雖然有所增加,但僅分別高出未接種處理30.18%、51.63%,感病品種葉片的MDA含量升高幅度大于抗病品種。在接種后第4天和第6天,感病品種‘V1197’葉片的MDA含量顯著高于抗病品種‘V4718’,表明感病品種的葉片細胞結構、細胞膜損傷比抗病品種嚴重。

圖2 綠豆抗病品種和感病品種葉片的丙二醛含量變化Fig.2 Changes of malondialdehyde content in leaves of resistant and the susceptible mungbean cultivars

2.2 葉斑病對抗氧化酶活性的影響

如圖3所示,接種之后,抗、感綠豆品種葉片的POD活性均明顯上升,隨后出現降低再升高的趨勢。抗病品種‘V4718’葉片的POD活性在接種后第1天快速升高,且顯著高于感病品種‘V1197’,而感病品種‘V1197’葉片的POD活性在接種后第2天才出現明顯增加。POD的及時響應可能在抵抗變灰尾孢菌侵染過程中起關鍵作用。

圖3 綠豆抗病品種和感病品種葉片的過氧化物酶活性變化Fig.3 Changes of peroxidase dismutase activity in leaves of resistant and the susceptible mungbean cultivars

如圖4所示,感病品種‘V1197’葉片的超氧化物歧化酶(SOD)活性在接種后第1天出現明顯上升,隨后保持穩定,在第6天出現下降,而抗病品種‘V4718’葉片的SOD活性在第1天達到最高值,高出未接種48.30%,隨后即出現下降。接種后第2天和第4天‘V1197’葉片的SOD活性顯著高于‘V4718’,推測‘V1197’體內可能產生了更多的破壞性的活性氧自由基,并且在持續增加,導致SOD活性一直偏高。

圖4 綠豆抗病品種和感病品種葉片的超氧化物歧化酶活性變化Fig.4 Changes of superoxide dismutase activity in leaves of the resistant and the susceptible mungbean cultivars

2.3 葉斑病對葉綠素熒光參數的影響

從圖5A和B可見,隨著接種時間的增加,兩個綠豆品種葉片的PSⅡ潛在光化學活性(potential activity of PSⅡ,Fv∕F0)和PSⅡ最大光化學活性Fv∕Fm變化趨勢相似。抗病品種‘V4718’僅在第2天出現明顯下降,隨后與未接種處理相比無明顯差異;而感病品種‘V1197’在接種后第4天和第6天出現明顯降低,Fv∕F0與未接種處理相比降低29.82%、46.43%,Fv∕Fm低于未接種處理13.75%、19.17%,且在接種后第4天和第6天抗病品種的Fv∕F0和Fv∕Fm均顯著高于感病品種,表明抗病品種的耗散過剩光能與光保護的能力均強于感病品種。從熒光衰減率(fluorescence decline ratio,Rfd)指數來看(圖5C),兩個品種均隨著接種時間的增加有下降趨勢,但接種后第2天、第4天、第6天抗病品種葉片的Rfd均顯著高于感病品種,表明感病品種的葉片活力下降更嚴重。從圖5D可見,隨著接種時間的增加,感病品種‘V1197’的光化學熒光猝滅(estimates the fraction of open photosystemⅡcenters,qL)在第4天出現顯著下降,抗病品種‘V4718’葉片的qL在接種后第4天和第6天均顯著高于感病品種。

圖5 綠豆抗病品種和感病品種葉片葉綠素熒光參數的變化Fig.5 Changes of chlorophyll fluorescence parameters in leaves of resistant and the susceptible mungbean cultivars

2.4 葉綠素熒光成像技術對葉斑病早期檢測的分析

如表1所示,在接種后1 d時,3種算法模型預測準確率在78.4%以上;接種后2 d時,3種算法模型的預測準確率在89.6%以上;接種后3 d時,3種算法模型的預測準確率均達到93.6%以上。同時可以看到,AUC值最低為0.86,大部分為0.9以上,表明葉綠素熒光成像技術在綠豆葉斑病早期檢測效果良好。

表1 綠豆葉斑病早期檢測結果Table 1 Early detection results of mungbean CLS

葉綠素熒光成像技術不僅可以獲得參數指標,也可以獲得每個參數對應的葉片熒光成像圖。相比較單一的數值,圖像可以更加直觀地顯示植物的發病情況。如圖6所示,在接種1 d、2 d時,RGB圖像未見明顯病斑時,熒光成像圖即可以檢測到熒光差別;而在接種3 d時,熒光成像圖不僅可以顯示出病斑所在位置,且可以觀察到葉片病斑周圍的熒光變化,對于病害的發展具有指示作用。

圖6 綠豆葉斑病病葉的葉綠素熒光成像圖Fig.6 Chlorophyll fluorescence images of leaves of mungbean CLS

3 討論與結論

變灰尾孢菌為絲孢菌綱(Hyphomycetes)暗色孢科(Dematiaceae)尾孢屬(Cercospora)真菌[21],在綠豆上引起的葉斑病屬于毀滅性病害[8]。植物遭受生物脅迫時體內會發生一系列的生理生化變化來抵抗病原生物的入侵,通過研究不同抗性品種體內的物質變化,可為探索病害的生理機制和篩選抗性品種提供理論基礎。劉麗等[22]通過研究不同品種葡萄接種霜霉菌之后生理指標的變化,發現抗性與防御酶活性成正相關,與葉綠素熒光參數成負相關;仁得元等[23]通過研究炭疽病對不同核桃的生理影響,發現脅迫后不同品種的膜脂過氧化程度和防御酶活性等存在差異,可以作為核桃對炭疽病抗性的參考指標;宋培玲等[24]通過研究不同抗性品種油菜接種黑脛病菌后防御酶活性變化,發現抗性與防御酶活性及響應早晚有關。本研究發現,接種變灰尾孢菌后,綠豆葉斑病抗感品種的丙二醛含量均有所升高,葉綠素含量均有所下降,這與黃志磊等[25]研究結果類似;感病品種與抗病品種相比,丙二醛含量上升早且增長較多,葉綠素含量下降較明顯,表明感病品種葉片的膜脂過氧化程度較深,葉綠素分子被破壞,體內正常的生理代謝活動嚴重受損,這與劉淑娜等[26]研究結果基本一致;防御酶活性變化與張海濤[27]研究略有不同,抗病品種的POD活性響應早于感病品種,酶活性的快速響應在病害侵染早期有重要意義;而對比SOD,抗病品種與感病品種較高的SOD活性相比,呈現曲折變化,但兩者均在第6天下降明顯;光合作用中的光系統Ⅱ對環境脅迫非常敏感,葉綠素熒光參數可以靈敏反應出光系統Ⅱ的損傷情況,本試驗中,與對照相比,接種后感病品種的PSⅡ潛在光化學活性和PSⅡ最大光化學活性出現顯著降低,抗病品種與未接種處理之間差異不大;穩態熒光衰減率靈敏度很高,而光化學熒光猝滅靈敏度較低,兩個品種隨均出現下降趨勢,但抗病品種與對照相比的下降幅度明顯低于感病品種,這與前人研究結論一致[22,28-29],表明葉斑病對易感品種的光合結構及光合效率影響較大。綠豆葉斑病抗性機理復雜,相關研究報道也較少。目前,雖然篩選出部分抗性資源,但抗性QTL定位研究只有一篇,近期本研究團隊成功定位到綠豆葉斑病的抗性基因VrTAF5[30],但抗性機理有待進一步研究。

葉綠素熒光技術是表型研究的新興技術,可以快速、無損地檢測逆境脅迫后植物光合作用的受損情況[31],同時結合機器算法模型對植物逆境脅迫檢測有巨大潛力。姚潔妮[32]用多光譜熒光成像技術與葉綠素熒光成像技術檢測耐旱能力不同的兩種擬南芥在干旱脅迫下的參數水平,結合支持向量機(SVM)和K近鄰法(KNN)兩種機器算法模型對其進行分類,實現了對擬南芥在干旱脅迫早期的分類和脅迫程度的數據化。隋媛媛等[33]通過獲取健康、感病3 d和6 d的黃瓜霜霉病葉片的熒光光譜,結合最小二乘支持向量機(partial least squares support vector machine,PLS-SVM)對黃瓜霜霉病病害的分類進行預測,準確率達到了97.73%。本研究針對‘V1197’接種變灰尾孢菌1 d、2 d、3 d后葉片的葉綠素熒光參數,利用主成分分析(PCA)降維,發現3種機器學習算法模型中,SVM最佳,KNN次之,DT最差,接種3 d后的判別準確率均達到93.6%以上。基于綠豆葉斑病早期的葉綠素熒光成像和參數變化特點,葉綠素熒光成像技術可以作為一種綠豆葉斑病早期檢測和診斷的輔助手段,若將該技術結合簡單易行、特異性高、可靠性強的環介導等溫擴增技術(LAMP)[34]在病害早期檢測、精準防控等方面的應用潛力巨大。

綜上所述,尾孢菌葉斑病對綠豆葉片的生長發育、光合作用均有不利影響,但尾孢菌葉斑病對抗病品種葉片的膜結構和光合作用損害程度較輕;抗病品種的抗氧化防御酶活性對尾孢菌葉斑病的響應更快。此外,葉綠素熒光成像技術結合機器學習算法可以作為綠豆葉斑病發病早期的輔助檢測手段。