新加腎元方調控RIPK1/RIPK3/MLKL通路對高糖誘導的糖尿病腎病腎小球足細胞損傷的影響

鄭 玲, 陳 立, 王 月

(湖北文理學院附屬醫院 襄陽市中心醫院， 湖北 襄陽 441021)

糖尿病腎病是由糖尿病患者長期血糖控制不佳引起的一種慢性并發癥，主要特征為腎臟微血管損傷、腎小球濾過率下降等，患者常伴有尿微量白蛋白增多、水腫、高血壓、貧血等臨床癥狀，影響正常生活[1,2]。目前研究指出，血流動力學異常、氧化應激、細胞凋亡等引起的腎小球濾過屏障破壞與糖尿病腎病密切相關[3]。蛋白尿與腎臟損傷相關，腎小球濾過率則與腎小球足細胞結構、功能相關。足細胞數量減少與壞死性凋亡相關，而壞死性凋亡途徑受TNF-α激活并與RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路密切相關[4]。現階段，糖尿病腎病的治療以降血糖、降血壓和控制飲食為主，但即使嚴格控制血糖和血壓，預后仍不理想[5]。所以研究糖尿病腎病的發病機制與新型藥物仍是研究人員的關注重點。中醫講，糖尿病腎病患者大多脾腎陽虛，新加腎元方是一種中藥方劑，方劑納入人參、炙黃芪、制附片、肉桂、淮山、熟地黃等多種中藥材，起到溫陽補腎效果[6]。本研究旨在探索新加腎元方中對糖尿病腎病起作用的活性成分，并分析新加腎元方對高糖誘導的糖尿病腎病大鼠腎小球足細胞損傷及RIPK1/RIPK3/MLKL通路的影響，現報道如下：

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1動物:健康清潔級SD大鼠70只，雄性，6月齡，體質量(230±10)g，許可證：SYXK(魯)2017-0001，合格證：37009200009757。飼養于12h光照/12h黑暗、溫度(25±1)℃、相對濕度(50±10)%的動物房內，飼養期間自由攝食、飲水。實驗前先適應性喂養7d。

1.1.2藥物:新加腎元方：人參6g、炙黃芪15g、制附片10g、肉桂10g、淮山30g、熟地黃15g、懷牛膝15g、澤瀉10g、山茱萸10g、丹參10g、菟絲子10g、炙甘草3g，乏力者人參10g，大便溏稀者加茯苓15g，食欲差者加砂仁6g，畏寒肢冷制附子15g，藥物由襄陽市中心醫院藥房提供。

1.1.3試劑及儀器:鏈脲佐菌素；肌酐測定試劑盒；尿素氮測定試劑盒；TNF-α ELISA試劑盒；IL-6 ELISA試劑盒；One Touch Ⅱ型血糖儀及配套試紙，RM 2135輪轉型切片機，全自動生化分析儀，光學顯微鏡，垂直電泳儀。

1.2方 法

1.2.1造模、分組及給藥:從70只大鼠中隨機選12只為正常對照組，另58只建立模型：高糖高脂飼料喂養4周，按35mg/kg一次性腹腔注射給予1%的STZ溶液，繼續高糖高脂飼料喂養1周，尾靜脈采血測定隨機血糖，并隨機取5只大鼠進行腎組織病理學檢查，以大鼠隨機血糖≥16.7mmoL/L且腎組織出現明顯病理學改變視為糖尿病腎病大鼠造模成功，共成功48只，隨機分為模型組，陽性對照組，新加腎元方低、高劑量組，各12只。藥物干預劑量如下：陽性對照組給予厄貝沙坦水溶液0.017g/kg灌胃，新加腎元方低、高劑量組分別給予0.72g/kg、1.44g/kg灌胃，正常對照組、模型組等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續12周。

1.2.2蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平:大鼠經藥物干預12周后入代謝籠，取24h尿液，離心取上清，檢測尿液中蛋白含量；用藥結束，麻醉，取腹主動脈血，離心取血清，檢測其余指標。

1.2.3HE染色觀察腎組織病理形態:藥物干預結束后處死大鼠，部分腎組織-80℃冰箱保存待用，剩余部分于10%中性甲醛固定1d，梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片。切片烘干后，二甲苯透明，無水乙醇處理5min，梯度乙醇各處理2min，清洗，蘇木素染色5min，清洗，0.5%鹽酸酒精分化，流水清洗返藍。0.5%伊紅染色2min，清洗1min，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察。

1.2.4透射電鏡觀察腎小球足細胞超微結構變化:步驟同上，透射電子顯微鏡下觀察腎小球足細胞超微結構的改變。

1.2.5TUNEL染色檢測腎組織細胞凋亡情況:切片脫蠟至水，加蛋白酶K(20μg/mL)，溫育，洗3次，5min/次，0.3%過氧化氫溶液室溫處理10min，洗3次，5min/次，加血清，溫育20min；加TdT反應液，濕盒避光孵育45min，沖洗，加過氧化物酶標記的抗體，濕盒避光30min，洗4次，5min/次，在組織切片上加顯色液，光鏡下觀察染色情況。

1.2.6ELISA檢測腎組織TNF-α、IL-6水平:取部分腎組織研磨，100mg腎組織/1mL預冷生理鹽水勻漿，勻漿液5000r/min離心15min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。TNF-α、IL-6單克隆抗體包被ELISA板，加標本、標準品和生物素化的抗大鼠抗體，標本、標準品中的待測因子與孔中生物素化的抗大鼠抗體及包被于酶標板上的單抗結合，形成免疫復合物，洗去游離成分，加辣根過氧化物酶標記的親合素，經底物顯色液顯色，測450nm OD值，繪制曲線求出TNF-α、IL-6濃度。

1.2.7WB檢測腎組織RIPK1/RIPK3/MLKL通路相關蛋白表達:腎組織研磨，100mg腎組織/1mL預冷RIPA裂解液，勻漿液12000r/min離心15min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，各管上清加5×Loading buffer50μL，100℃煮沸15min，蛋白變性。10% SDS-PAGE分離蛋白樣品，轉膜，封閉2h，TBST洗3次，抗RIPK1、RIPK3、MLKL、WT-1、β-actin抗體(1∶1000)孵育過夜，次日加入二抗1∶5000)，孵育1h，洗膜，檢測蛋白。

1.2.8新加腎元方中所含活性成分收集與篩選:中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)檢索新加腎元方的活性成分，篩選出活性成分較高的化合物，并查閱相關文獻作為補充。

1.2.9新加腎元方中不同活性成分與RIPK1/RIPK3/MLKL的分子對接:TCMSP數據庫中檢索方劑中活性成分的2D結構，YASARA分子模擬軟件去H2O、加H質子化和添加缺失原子，Cytoscape對人參、炙黃芪、肉桂、制附片的有效成分進行分析，PyMOL、AutoDock Vina等軟件對關鍵成分及主要靶點進行分子對接。

2 結 果

2.1大鼠蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平：與正常對照組相比，模型組大鼠蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、新加腎元方低、高劑量組大鼠蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平下降(P<0.05)；陽性對照組與高劑量組大鼠蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 大鼠蛋白尿血清肌酐和尿素氮水平

2.2大鼠腎組織病理形態：正常對照組腎組織形態正常，無異常改變；模型組大鼠腎小球基底膜變厚，系膜細胞增生，腎小管濁腫變性，腎間質纖維化；陽性對照組、新加腎元方低、高劑量組腎組織病理形態改變較模型組出現不同程度減輕，見圖1。

圖1 大鼠腎組織病理形態(×400)

2.3大鼠腎小球足細胞超微結構變化：正常對照組大鼠腎小球足細胞超微結構正常，無異常改變；模型組大鼠足細胞足突融合或消失，基底膜增厚；陽性對照組、新加腎元方低、高劑量組大鼠腎組織超微結構病理形態改變較模型組出現不同程度改善，見圖2。

圖2 大鼠腎小球足細胞超微結構變化(×7000)

2.4大鼠腎組織細胞凋亡情況：與正常對照組相比，模型組大鼠凋亡指數增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、新加腎元方低、高劑量組大鼠凋亡指數下降(P<0.05)；陽性對照組與高劑量組凋亡指數差異無統計學意義(P>0.05)，見表2，圖3。

圖3 大鼠腎組織細胞凋亡情況(×200)

表2 大鼠腎組織細胞凋亡指數

2.5大鼠腎組織TNF-α、IL-6水平：與正常對照組相比，模型組大鼠TNF-α、IL-6水平增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、新加腎元方低、高劑量組大鼠TNF-α、IL-6水平下降(P<0.05)；陽性對照組與高劑量組TNF-α、IL-6水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 大鼠腎組織TNF-α IL-6水平

2.6大鼠腎組織RIPK1/RIPK3/MLKL通路相關蛋白表達：與正常對照組相比，模型組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白表達增加，WT-1蛋白表達下降(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、新加腎元方低、高劑量組大鼠RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白表達下降，WT-1蛋白表達增加(P<0.05)；陽性對照組與高劑量組RIPK1、RIPK3、MLKL、WT-1蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表4、圖4。

圖4 RIPK1/RIPK3/MLKL通路相關蛋白表達

表4 RIPK1/RIPK3/MLKL通路相關蛋白表達

2.7新加腎元方的活性成分的篩選：新加腎元方的主要中藥成分為人參、炙黃芪、制附片、肉桂。在TCMSP中檢索人參、炙黃芪、肉桂所有成分數據，設置口服生物利用度OB≥30%，藥物相似性DL≥0.18，同時篩去無對應靶點的成分，最終篩選出人參主要活性成分22個，炙黃芪主要活性成分20個、制附和肉桂主要活性成分0個，見表5。

表5 新加腎元方的活性成分的篩選

2.8分子對接分析：在TCMSP中檢索人參、炙黃芪、肉桂、制附片的有效成分并進行分析，根據degree結果得出新加腎元方中評分較高的活性成分有人參中的Celabenzine、炙黃芪中的Mairin。運用PyMOL、AutoDock Vina等軟件對關鍵成分及主要靶點進行分子對接，見圖5、圖6。同時對主要有效成分作用于RIPK1、RIPK3、MLKL的結合能進行了測定。RIPK1、RIPK3、MLKL的晶體結構從uniprot中下載，序列號4NEU、7MX3、5KO1，分辨率為2.57、3.23、2.16，人參中的Celabenzine、炙黃芪中的Mairin與RIPK1、RIPK3、MLKL的結合能分別為-5.3、-6.42、-5.48和-5.39、-7.71、-5.41，由此可見新加腎元方中的核心有效成分炙黃芪中的Mairin與RIPK3形成構象能量低，結構穩定，結合活性較高，見表6。

表6 新加腎元方中活性成分與靶點的結合能

圖5 新加腎元方中主要活性成分與RIPK1、RIPK3、MLKL作用的2d圖

圖6 新加腎元方中主要活性成分與RIPK1、RIPK3、MLKL的結合模式

3 討 論

研究表明[3]，2016年全世界大約有4.2億人群患者有糖尿病，這些糖尿病患者中絕大多數為2型糖尿病，典型表現為喝水多、吃飯多、尿多和體重減輕，該病目前無法治愈，確診后需終身服用藥物，因此嚴重影響了患者的生活質量。糖尿病易引發糖尿病腎病的并發癥，約20%左右的糖尿病患者患有糖尿病腎病，該病是多因素相互作用產生的結果，也是是造成終末期腎臟病的最主要原因，該病主要的病理行為包括腎小球濾過率增加、基底膜增厚和細胞外機制的積累，但具體的發病機制仍有待研究。研究指出，糖尿病腎病的發病與足細胞損傷密切相關，而壞死性凋亡是足細胞損傷與數量減少的重要原因，且壞死性凋亡為糖尿病腎損傷的一種重要細胞死亡模式，不依賴Caspase激活且具有典型壞死樣形態，其通過RIPK1/RIPK3/MLKL途徑進行調節[6]。新加腎元方是具有溫陽補腎、益氣養陰、健脾利尿效用的中藥方，而糖尿病腎病患者恰以脾腎陽虛型多見，因此，本研究旨在探索新加腎元方對高糖誘導的糖尿病腎病大鼠腎小球足細胞損傷及RIPK1/RIPK3/MLKL通路的影響，并分析其可能的作用機制。

中醫認為糖尿病腎病從氣陰兩虛到陰陽兩虛最終發展到氣血陰陽俱虛的過程，血瘀證貫穿疾病始終。所以治療糖尿病腎病應溫陽補腎，益氣養陰，這對疾病的治療非常關鍵。新加腎元方是補腎益氣的中藥方劑，對糖尿病腎病亦具有治療效果，藥劑中人參大補元氣、補脾益肺、生津液、安神，為君藥；炙黃芪益氣補中滋補脾肺，制附片溫補陽氣，肉桂補元陽、暖脾胃、除積冷、通血脈，淮山補脾胃虧損、治氣虛衰弱，熟地黃滋陰、補血、治陰虛血少、腰膝痿弱，懷牛膝補肝益腎，為臣藥；澤瀉治腎炎水腫、腎盂腎炎、腸炎泄瀉、小便不利，山茱萸補血固精、補益肝腎、調氣、補虛、明目、強身，丹參可治腎孟腎炎，菟絲子補腎、肝、脾，為佐藥，炙甘草益氣滋陰，通陽復脈為使藥，上述藥物共用以達溫陽補腎、益氣養陰、健脾利尿的功效。在TCMSP檢索中發現新加腎元方中的人參主要活性成分22個，炙黃芪主要活性成分20個，這對糖尿病腎病的治療具有著重要意義。研究中也指出，新加腎元方干預后，糖尿病腎病大鼠蛋白尿、血清肌酐、尿素氮水平、凋亡指數、TNF-α、IL-6水平下降，腎組織病理改變及腎小球足細胞超微結構改變得到緩解，這提示新加腎元方可改善糖尿病腎病大鼠腎功能，減輕腎組織損傷。

研究指出，壞死性凋亡是經RIPK1/RIPK3/MLKL通路調節的糖尿病腎損傷的一種細胞死亡模式，且壞死性凋亡是腎小球足細胞損傷、減少的原因[7]。相關研究指出，TNF-α可激活TNFR1誘導RIPK1的表達，Caspase-8是凋亡、壞死性凋亡的關鍵，抑制Caspase-8激活，RIPK1去泛素化招募RIPK3，RIPK1/RIPK3復合招募并磷酸化MLKL，MLKL孔通過允許離子流入、細胞膨脹和膜溶解導致壞死性細胞死亡并誘發炎癥，所以，RIPK1與RIPK3形成復合體以及MLKL的磷酸化是壞死性凋亡的特異標志，MLKL扮演壞死性凋亡執行器角色，MLKL的N-端直接誘導膜破裂[8]。WT-1存在于足細胞核，是足細胞特異性標志以反映足細胞損傷程度及數量。本實驗中，新加腎元方干預后，糖尿病腎病大鼠TNF-α，IL-6表達下降，RIPK1/RIPK3/MLKL蛋白表達下降、WT-1蛋白表達增加，這提示新加腎元方通過調控RIPK1/RIPK3/MLKL通路減輕腎損傷。

綜上所述，新加腎元方通過多成分、多靶點調控RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路的表達水平，減輕腎組織病理損傷，改善腎小球足細胞超微結構變化，抑制腎組織細胞凋亡，降低炎癥因子TNF-α、IL-6水平，緩解炎癥反應，保護腎功能。