雙醋瑞因介導(dǎo)軟骨細(xì)胞焦亡修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的機(jī)制研究

袁 磊， 劉志元， 薛 濤， 楊 雷

(江蘇省常州市武進(jìn)人民醫(yī)院南院骨科， 江蘇 常州 213000)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是最常見的關(guān)節(jié)炎類型，也是全球老年人致殘的最重要的退行性關(guān)節(jié)病之一[1]。在全球范圍內(nèi)，2017 年 OA 影響了 3.03 億人[2]，其中 9.6% 的男性和 18.0% 的 60 歲以上的女性患有 OA 癥狀。OA可以影響任何關(guān)節(jié)，尤其是影響膝、髖、手和脊柱，導(dǎo)致患者疼痛和殘疾，并給社會帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在 OA 中，骨骼變得更硬，吸收沖擊載荷的能力降低，導(dǎo)致軟骨承受更多壓力。OA 的共同特征包括軟骨損失、關(guān)節(jié)間隙變窄、肥大性骨改變[3]。OA最常見的癥狀是慢性疼痛。殘疾和疼痛都會導(dǎo)致生活質(zhì)量顯著下降[4]。而雙醋瑞因 (DCN) 被認(rèn)為是一種結(jié)構(gòu)修飾的 OA 藥物，可特異性地阻礙人類單核細(xì)胞中的白細(xì)胞介素-1b (IL-1b)，對軟骨的修飾具有重要作用 。DCN 通常用于管理 OA 癥狀，針對主要原因，從而阻礙疾病的進(jìn)展。近年來國外研究結(jié)果表明，雙醋瑞因能夠很好地改善 OA 的癥狀和抑制 OA 的發(fā)展[5]。但雙醋瑞因?qū)τ贠A的作用機(jī)制并不明確，需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究和探索。同時有研究報道，涉及肌腱損傷和肌腱愈合的各種基因和生長因子受 siRNA 和 microRNA (miRNA) 的調(diào)控，從而參與了 OA 的發(fā)生和發(fā)展[6]。研究miRNA在關(guān)節(jié)生理和病理中的作用，可為OA的診斷、預(yù)防和治療提供參考[7]。miRNA 是小的單鏈 RNA，與多種疾病有關(guān)，如癌癥、OA 和糖尿病[8]。據(jù)報道，miR-155 在脂多糖 (LPS) 誘導(dǎo)的炎癥性關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中上調(diào)[9]。miR-155 通過調(diào)節(jié)相應(yīng)的蛋白質(zhì)參與細(xì)胞焦亡。SMAD 家族成員 2 (SMAD2) 在將細(xì)胞外信號從 TGF-β 超家族配體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中發(fā)揮重要作用，從而調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程，例如細(xì)胞分化、增殖和凋亡[10]。CircCDK14 通過促進(jìn) SMAD2 表達(dá)來預(yù)防 OA 。核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3 (NLRP3)/caspase-1 通路參與 NLRP3 介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的焦亡、釋放和成熟[11]。SMAD2/3通路的激活可以抑制NLRP3的轉(zhuǎn)錄，從而減少缺氧心肌細(xì)胞的焦亡。但目前還沒有關(guān)于雙醋瑞因能否通過調(diào)控miR-107/SMAD2Z軸影響aspase-1通路的激活，從而影響KOA軟骨細(xì)胞焦亡的報道。本研究從基因角度推測了雙醋瑞因與miR-107對KOA軟骨細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制，為KOA的治療提供了可能。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組:軟骨細(xì)胞獲自北京澤平科技有限公司(中國北京)。使用含有20%胎牛血清(FBS; Gibco,USA) 的 DMEM 培養(yǎng)基，在37℃和5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。本研究使用的細(xì)胞分組如下：Blank組(不經(jīng)任何處理)；LPS組(用 1μg/mL LPS 處理 24 h)；LPS+mimics-miR-107組(用 1μg/mL LPS 處理 24 h后，將miR-107 mimics轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞內(nèi))；LPS+mimics-NC組(用1μg/mL LPS處理24h后，將mimics NC轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞內(nèi))；DCN組(用1μg/mL LPS處理24h后，用10-5moL/L的雙醋瑞因處理72h)。其中miRNA模擬物(miR-107mimics)、miRNA模擬物陰性對照(miR-107mimics-NC)購自RIBOBIO(中國廣州)。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，48h后用于后續(xù)實驗。

1.2酶聯(lián)免疫吸附試驗:通過離心管收集軟骨細(xì)胞上清液，將其離心并轉(zhuǎn)移到滅菌管中。接下來，使用LPS誘導(dǎo)的小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中炎癥因子IL-1β(MLB00C，R&D SYSTEMS，Minneapolis，MN，USA)和 IL-18(FK-KJ2900，F(xiàn)ANKE)的釋放水平進(jìn)行測定。相應(yīng)的Quantikine ELISA試劑盒。

1.3qRT-PCR分析:根據(jù)制造商的說明，使用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)提取總 RNA。使用 NanoDrop-1000(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA) 測量 RNA 濃度。然后根據(jù)制造商的建議進(jìn)行cDNA合成。簡而言之，使用 ReverAid First Strand cDNA 試劑盒(Thermo Fisher Scientific)結(jié)合miR-107引物對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)。U6和GAPDH分別用作標(biāo)準(zhǔn)化 miR-107 和 SMAD2 表達(dá)水平的內(nèi)部對照。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，使用 LightCycler 480 SYBR-Green I Master 和 LightCycler 480 實時 PCR 系統(tǒng)(均來自 Roche Applied Science)檢測 miR-107 和 SMAD2 mRNA的表達(dá)。miR-107 和 SMAD2的相對表達(dá)量由2-ΔΔCt法計算所得。相關(guān)引物序列皆由上海英拜生物科技有限公司設(shè)計合成。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR中所用引物序列

1.4蛋白質(zhì)印跡分析:使用 RIPA 裂解緩沖液勻漿來自細(xì)胞的總蛋白質(zhì)。并且通過BCA蛋白質(zhì)試劑(Sangon Biotech Co.,Ltd.，China，Shanghai)測定蛋白質(zhì)濃度。如前所述進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。一抗如下：SMAD2兔多克隆抗體(ab280888，Abcam，USA，1∶1000)，Caspase-1兔多克隆抗體(ab138483，Abcam，UK，1∶1000)；二抗如下：山羊抗兔IgG H&L (HRP)(ab97051，Abcam，UK，1∶20000)。抗β-肌動蛋白抗體用作內(nèi)參。使用 Bio-Rad 數(shù)碼圖像系統(tǒng)拍照并保存分析圖片，采用Image J軟件(National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA)對目的條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.5熒光素酶報告基因測定:進(jìn)行熒光素酶測定以鑒定miR-107和SMAD2之間的相互作用。WT-SMAD2或MUT-SMAD2分別用mimics-miR-107或mimics-NC通過Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen,Shanghai,China)轉(zhuǎn)染到軟骨細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)(Promega)檢測熒光素酶活性。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析:本研究數(shù)據(jù)使用SPSS21.0(SPSS，Inc，Chicago，IL，USA)和GraphPad Prism 8.01(GraphPad Software Inc)統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。連續(xù)變量的正態(tài)分布采用Kolmogorov-SmiRnov驗證。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采取獨(dú)立樣本t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用one-way ANOVA，事后檢驗采用Tukey's multiple comparisons test。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1在LPS誘導(dǎo)的小鼠KOA軟骨細(xì)胞中miR-107低表達(dá)而SMAD2高表達(dá):膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的miR-107與KOA密切相關(guān)[9]。為探討其機(jī)制，本研究通過LPS誘導(dǎo)小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，建立軟骨細(xì)胞炎癥模型(LPS組)。qRT-PCR的結(jié)果表明，與Blank組相比，LPS組miR-107的表達(dá)水平顯著下調(diào)，而SMAD2的表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖1A/B，均P<0.05)，Western blot的結(jié)果表明，與Blank組相比，LPS組SMAD2的表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖1C，P<0.05)。上述結(jié)果說明在LPS誘導(dǎo)的小鼠KOA軟骨細(xì)胞中miR-107低表達(dá)而SMAD2高表達(dá)，miR-107和SMAD2均可能參與了KOA的發(fā)生。

圖1 在LPS誘導(dǎo)的小鼠KOA軟骨細(xì)胞中miR-107低表達(dá)而SMAD2高表達(dá)qRT-PCR分別檢測miR-107(A)與SMAD2(B)的表達(dá)水平；Western blot法檢測SMAD2的表達(dá)水平(C)。細(xì)胞實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，*表示P<0.05

2.2miR-107過表達(dá)降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡:焦亡與炎癥性疾病密切相關(guān)，在關(guān)節(jié)炎中起重要作用，抑制軟骨細(xì)胞焦亡可以改善關(guān)節(jié)炎。為了探索miR-107是否可以調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的KOA軟骨細(xì)胞焦亡，我們對miR-107在LPS誘導(dǎo)的KOA軟骨細(xì)胞中進(jìn)行了過表達(dá)。同時使用qRT-PCR檢測軟骨細(xì)胞中miR-107的表達(dá)。與LPS+mimics-NC組相比，LPS+mimics-miR組中miR-107表達(dá)上調(diào)(P<0.05)(圖2A)，表明miR-107成功進(jìn)行了過表達(dá)。隨后，通過Western blot檢測細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1的結(jié)果顯示：與正常組相比，LPS組Caspase-1水平升高，而miR-107過表達(dá)后顯著降低了Caspase-1水平(均P<0.05)(圖2B)。最后，使用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞中炎癥因子的水平。與正常組相比，LPS組IL-1β和IL-18水平升高，而miR-107過表達(dá)顯著降低了促炎因子的釋放(均P<0.05)(圖2C/D)。簡而言之，miR-107的過表達(dá)可以抑制LPS誘導(dǎo)的KOA軟骨細(xì)胞焦亡。

圖2 miR-107過表達(dá)降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡qRT-PCR檢測miR-107(A)的表達(dá)水平；Western blot法檢測細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1(B)的表達(dá)；ELISA檢測炎癥因子IL-1β(C)和IL-18(D)的表達(dá)。細(xì)胞實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用one-way ANOVA，事后檢驗采用Tukey's multiple comparisons test，*表示P<0.05

2.3miR-107靶向抑制SMAD2:為進(jìn)一步探究miR-107與SMAD2的關(guān)系，我們首先通過starbase在線數(shù)據(jù)庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測miR-107和SMAD2之間的結(jié)合位點(圖3A)。隨后通過雙熒光素酶測定進(jìn)行驗證，結(jié)果表明，與共轉(zhuǎn)染mimics-NC和SMAD-WT的正常小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染mimics-miR-107和SMAD-WT的軟骨細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.01)，而用SMAD-MUT轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞中熒光素酶活性沒有顯著變化(圖3B)。先前的一項研究表明，SMAD2 在關(guān)節(jié)炎中至關(guān)重要，并且在SMAD2敲低后可以抑制軟骨細(xì)胞的增殖和遷移[10]。因此，采用qRT-PCR和Western blot檢測軟骨細(xì)胞中SMAD2的mRNA水平和蛋白水平(圖3C/D)，結(jié)果表明：miR-107的過表達(dá)顯著降低了SMAD2的水平(均P<0.05)。上述結(jié)果表明，SMAD2是miR-107的靶基因。

圖3 miR-107靶向抑制SMAD2Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-107與SMAD2(A)的靶向結(jié)合位點；雙熒光素酶實驗驗證miR-107與SMAD2(B)的靶向關(guān)系；qRT-PCR(C)與Western blot(D)分別檢測SMAD2的表達(dá)情況。細(xì)胞實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，*表示P<0.05，**表示P<0.01

2.4雙醋瑞因可通過促進(jìn)miR-107的表達(dá)降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡:最后，為探究雙醋瑞因介導(dǎo)軟骨細(xì)胞焦亡修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的機(jī)制，我們通過qRT-PCR和Western blot檢測了miR-107以及SMAD2的表達(dá)情況，結(jié)果表明：與LPS組相比，DCN組的miR-107水平顯著升高，SMAD2水平顯著降低(圖4A/B/C，均P<0.05)；此外，Western blot檢測Caspase1的結(jié)果表明，與LPS組相比，DCN組的Caspase1蛋白顯著升高(圖4D，P<0.05)；同時ELISA試驗的結(jié)果表明，與LPS組相比，DCN組的炎癥因子IL-18與IL-1β均顯著降低(圖4E/F，均P<0.05)。上述結(jié)果表明雙醋瑞因可通過促進(jìn)miR-107的表達(dá)降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡。

圖4 雙醋瑞因可通過促進(jìn)miR-107的表達(dá)降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞焦亡qRT-PCR分別檢測miR-107(A)與SMAD2(B)的表達(dá)水平；Western blot法檢測SMAD2的表達(dá)水平(C)；Western blot法檢測細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1(D)的表達(dá)；ELISA檢測炎癥因子IL-1β(E)和IL-18(F)的表達(dá)。細(xì)胞實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，*表示P<0.05

3 討 論

在本研究中，雙醋瑞因通過過表達(dá)miR-107介導(dǎo)SMAD2下調(diào)從而調(diào)控Caspase-1的表達(dá)來抑制軟骨基質(zhì)降解，這為我們在藥物開發(fā)中將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為對患者的實際治療，能夠填補(bǔ)基礎(chǔ)科學(xué)與臨床科學(xué)之間的空白。而軟骨退變常被認(rèn)為是KOA進(jìn)展的主要原因，軟骨細(xì)胞功能的改善對KOA的恢復(fù)很重要。本研究采用LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞構(gòu)建體外KOA模型。

經(jīng)典的細(xì)胞焦亡主要依賴于炎癥小體激活的Caspase-1，Caspase-1表達(dá)增加與NLRP3炎性體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡信號傳導(dǎo)有關(guān)。此外，有研究報道[12]證明氧化的低密度脂蛋白和膽固醇晶體激活巨噬細(xì)胞中的NLRP3炎性體，進(jìn)一步激活Caspase-1成熟的促炎因子(IL-1β和IL-18)，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡。痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎是一種由尿酸鈉(MSU)晶體或焦磷酸二水合物(CPPD)晶體引起的炎癥性疾病。MSU和CPPD被NALP3炎性體識別以激活NALP3，然后激活Caspase-1以產(chǎn)生誘導(dǎo)炎癥的成熟IL-1β和IL-18。在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作時，TLR4信號通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡。TLR4信號識別MSU并與MyD88相互作用激活NF-κB，從而調(diào)節(jié)pro-IL-1β的表達(dá)，將其切割成成熟的IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。

Caspase-1的激活是細(xì)胞焦亡的核心。一項研究表明，針對NLRP3炎性體的抗炎療法可能是治療OA的一種新方法。有報道稱，膠原性關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)滑液中NLRP3、IL-18、IL-1β的表達(dá)明顯升高，且NLRP3的表達(dá)與臨床關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度相關(guān)。還有報道發(fā)現(xiàn)OA患者滑膜中的尿酸可通過激活NLRP3炎性體激活pro-IL-18和pro-IL-1β，并且滑膜中的IL-18和IL-1β與OA的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。因此，我們推測細(xì)胞焦亡可能參與了OA的過程。本研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)作用下軟骨細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、IL-18的表達(dá)增加，這一發(fā)現(xiàn)與之前的研究一致。此外，雙醋瑞因?qū)е翪aspase-1表達(dá)增加，刺激軟骨細(xì)胞焦亡。

近期，miRNA被證明對KOA發(fā)展具有一定的調(diào)節(jié)作用。據(jù)報道m(xù)iR-107在OA中下調(diào)，且提高miR-107表達(dá)水平可以減輕軟骨細(xì)胞損傷。在本研究中，在LPS誘導(dǎo)下，軟骨細(xì)胞miR-107表達(dá)水平降低，SMAD2表達(dá)水平上升，而雙醋瑞因處理使得軟骨細(xì)胞miR-107及SMAD2表達(dá)水平都出現(xiàn)部分逆轉(zhuǎn)。因此，我們猜測miR-107與SMAD2表達(dá)水平之間可能存在一定聯(lián)系，隨后通過starbase在線數(shù)據(jù)庫及雙熒光素酶實驗預(yù)測并證明miR-107靶向調(diào)控SMAD2，這輔佐了miR-107過表達(dá)下調(diào)SMAD2表達(dá)以減少細(xì)胞焦亡并促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的現(xiàn)象。此外，雙醋瑞因處理同樣降低LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中IL-1β和IL-18的表達(dá)，以上現(xiàn)象皆說明雙醋瑞因能通過促進(jìn)miR-107的表達(dá)從而介導(dǎo)軟骨細(xì)胞焦亡修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷。