miR-383-3p靶向PTEN/PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)冠心病大鼠內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

蔡貴東， 靳孟妮， 王小軍， 王宗社， 舒瑞朝， 段朝陽(yáng)， 馬 恩

(1.陜西省寶雞市中心醫(yī)院， 陜西 寶雞 7210002.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 陜西 西安 710004)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CHD)是以動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)為病理基礎(chǔ)的心血管疾病，而內(nèi)皮細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是AS發(fā)生的啟動(dòng)因素[1～3]。因此，有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能是CHD有前景的治療方法，但目前影響內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制仍然未闡明。微小RNA(miRNA)作為長(zhǎng)度約18-22個(gè)核苷酸的非編碼小型內(nèi)源性RNA，可通過(guò)與目標(biāo)mRNA 3'UTR區(qū)配對(duì)來(lái)負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[3]。有研究揭示miR-383-3p在AS、冠狀動(dòng)脈疾病等血管疾病中具有重要作用[4,5]，AS大鼠心肌組織中miR-383-3p下調(diào)，其過(guò)表達(dá)可抑制冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[4]。但miR-383-3p在CHD中的詳細(xì)作用機(jī)制還不甚清楚。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten/Phosphoinositide 3-kinases/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PTEN/PI3K/AKT/mTOR)在細(xì)胞凋亡、自噬過(guò)程中具有重要調(diào)控作用，抑制PI3K/AKT通路可誘導(dǎo)CHD小鼠內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[6]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-383-5p在乳腺癌中可通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR通路發(fā)揮抗腫瘤作用[7]，而其對(duì)CHD的影響是否與該通路有關(guān)還未可知，基于此，本研究以期通過(guò)探究miR-383-3p靶向PTEN/PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)CHD大鼠內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，為CHD治療機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:將從昆明醫(yī)科大學(xué)購(gòu)得的90只SD大鼠(SPF級(jí)，215-260g)于通風(fēng)良好及12h/12h正常晝夜交替的環(huán)境飼養(yǎng)，許可證：SCXK(滇)K2020-0004。本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2試劑及儀器:293T細(xì)胞(CM8693X，上海淳麥生物科技)；HE染色試劑盒、Lipofectamine 2000 Transfection Reagent、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(AR1180、11668027、E-EL-R1430km，上海恒斐生物)；BCA試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(E112-01/02、DD1205-01/02，南京諾唯贊)；TUNEL試劑盒、一氧化氮(Nitric Oxide，NO)(1521、XFR31390，上海信帆生物)；兔抗Bcl-2、Bax抗體、Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)(ab182858、ab32503、ab6721，Abcam)；兔抗PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、PTEN、GAPDH、mTOR、p-mTOR抗體(4249、9272、4228、4060、9559、2118、2983、2971，Cell Signaling Technology)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time，qRT-PCR)試劑盒(F-430，北京美科美生物)；內(nèi)皮素-1(endothelin 1，ET-1)(YS04235B，上海雅吉生物)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)(ab100786，深圳海思安生物)；凝膠成像系統(tǒng)E-Gel Imager(廣州市科之藍(lán)儀器)；全自動(dòng)生化分析儀PUZS-300(上海帝博思生物)。

1.3 方 法

1.3.1分組和CHD模型大鼠構(gòu)建:將大鼠分為control組、CHD組(模型組)、mimic NC組、miR-383-3p mimic組、miR-383-3p mimic+pcDNA3.1組、miR-383-3p mimic+pcDNA3.1-PTEN組，每組15只；造模前24h及造模后每?jī)芍?，mimic NC組、miR-383-3p mimic組、miR-383-3p mimic+pcDNA3.1組、miR-383-3p mimic+pcDNA3.1-PTEN組大鼠分別于尾靜脈注射100μL慢病毒液(50μg/100mL)及質(zhì)粒，control組、CHD組注射等量生理鹽水；除control組外其余組大鼠進(jìn)行CHD模型構(gòu)建：連續(xù)6周飼喂大鼠高脂飼料(豬油15%、膽固醇5%、膽酸鈉0.2%、丙基硫氧嘧啶0.2%+基礎(chǔ)飼料79.6%)后間隔24h，連續(xù)3d腹腔注射垂體后葉素(30μg/kg)[8]，生理記錄儀進(jìn)行心電圖檢測(cè)，Ⅱ?qū)?lián)心電圖中J點(diǎn)位移均≥0.2mV，表明全部建模成功[9]；control組飼喂正?；A(chǔ)飼料并腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3.2qRT-PCR檢測(cè)冠狀動(dòng)脈miR-383-3p、PTEN表達(dá):造模結(jié)束后從每組大鼠中隨機(jī)挑選5只，頸椎脫臼處死后室溫下分離獲取其冠狀動(dòng)脈，經(jīng)液氮冷凍后，添加預(yù)冷的Trizol試劑進(jìn)行勻漿，依次添加氯仿、異丙醇、乙醇處理以提取冠狀動(dòng)脈總RNA，經(jīng)微量核酸儀測(cè)定其濃度及純度后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，分別以U6、GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增(引物見(jiàn)表1)，擴(kuò)增程序：95℃ 30s、95℃變性5s、60℃退火30s、72℃延伸30s，×30，2-△△Ct計(jì)算miR-383-3p、PTEN表達(dá)(n=5)。

表1 引物序列

1.3.3全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血脂水平:抽取大鼠腹主動(dòng)脈血5mL，靜置1h后，進(jìn)行3000r/min離心(15min)取上清液，4℃保存。使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中三酰甘油(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、總膽固醇(Total Cholesterol，TC)水平(n=10)。

1.3.4ELISA法檢測(cè)血清AngⅡ、ET-1、VEGF、NO水平:使用ELISA試劑盒檢測(cè)2.3所得血清中AngⅡ、ET-1、VEGF、NO水平(n=10)。

1.3.5HE染色觀察冠狀動(dòng)脈組織病理變化:從每組中挑選5只大鼠，將其冠狀動(dòng)脈組織浸于多聚甲醛中，脫水后將組織包埋于石蠟中，制成4μm切片后HE染色，依次經(jīng)脫水、透明、封片后光鏡下觀察(×200)。

1.3.6TUNEL法檢測(cè)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡:將2.5所制切片置于TUNEL反應(yīng)液中進(jìn)行避光孵育(1h)，PBS洗滌，經(jīng)過(guò)DAB染色及封片后于400倍光鏡下觀察棕黃色凋亡細(xì)胞(n=5)，凋亡指數(shù)(AI)%=(凋亡數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.3.7雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-383-3p與PTEN靶向關(guān)系:starBase2.0網(wǎng)址預(yù)測(cè)miR-383-3p與PTEN的結(jié)合位點(diǎn)；將PTEN上與miR-383-3p結(jié)合的片段進(jìn)行擴(kuò)增后插入到pmirGLO載體，以構(gòu)建野生型PTEN-wt質(zhì)粒；使用基因突變技術(shù)對(duì)二者結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型PTEN-mut質(zhì)粒。將293T細(xì)胞分為PTEN-wt+miR-383-3p mimics組、PTEN-wt+mimic NC組、PTEN-mut+miR-383-3p mimics組、PTEN-mut+mimic NC組，將mimic NC、miR-383-3p mimics分別與PTEN-wt、PTEN-mut共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，經(jīng)24h培養(yǎng)后測(cè)定螢火蟲(chóng)、海腎熒光值，計(jì)算293T細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性；將293T細(xì)胞分為control組、mimic NC組、miR-383-3p mimics組，使用mimics-NC、miR-383-3p進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Western blot檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)。

1.3.8Western blot檢測(cè)冠狀動(dòng)脈組織Bcl-2、Bax及PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達(dá):將每組其余5只大鼠處死，取冠狀動(dòng)脈組織于冰上裂解并提取總蛋白，BCA法定量后通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜及封閉后孵育GAPDH、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax、PTEN、mTOR、p-mTOR抗體(兔抗1∶1000)一抗過(guò)夜(4℃)，次日孵育經(jīng)1∶2000稀釋的HRP-IgG二抗，ECL顯色，通過(guò)凝膠成像儀曝光拍照，Image J軟件分析各蛋白的條帶灰度值，計(jì)算PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax、PTEN、mTOR、p-mTOR表達(dá)(n=5)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠冠狀動(dòng)脈組織miR-383-3p、PTEN表達(dá)比較:結(jié)果顯示miR-383-3pmimic可顯著增加miR-383-3p表達(dá)水平(P<0.05)，pcDNA3.1-PTEN可顯著增加PTEN mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠冠狀動(dòng)脈組織miR-383-3p、PTEN表達(dá)比較注：與control組相比，aP<0.05；與CHD組相比，bP<0.05；與miR-383-3p mimic組相比，cP<0.05

2.2各組大鼠血脂水平比較:結(jié)果顯示CHD大鼠TG、LDL-C、TC水平顯著增加(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，miR-383-3p過(guò)表達(dá)可顯著降低CHD大鼠TG、LDL-C、TC水平(P<0.05)，顯著增加HDL-C水平(P<0.05)，而PTEN高表達(dá)則可顯著逆轉(zhuǎn)miR-383-3p對(duì)CHD大鼠血脂水平的改善作用(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠血脂水平比較注：與control組相比，aP<0.05；與CHD組相比，bP<0.05；與miR-383-3p mimic組相比，cP<0.05

2.3各組大鼠血清AngⅡ、ET-1、VEGF、NO水平比較:結(jié)果顯示，CHD大鼠血清ET-1、AngⅡ水平顯著升高(P<0.05)，VEGF、NO水平顯著減少(P<0.05)；miR-383-3p過(guò)表達(dá)可顯著降低CHD大鼠ET-1、AngⅡ水平(P<0.05)，顯著增加VEGF、NO水平(P<0.05)；而PTEN高表達(dá)則可顯著逆轉(zhuǎn)miR-383-3p對(duì)CHD大鼠內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的改善作用(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠血清AngⅡ、ET-1、VEGF、NO水平比較注：與control組相比，aP<0.05；與CHD組相比，bP<0.05；與miR-383-3p mimic組相比，cP<0.05

2.4HE染色觀察冠狀動(dòng)脈組織病理變化:結(jié)果顯示CHD大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)構(gòu)模糊形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)皮細(xì)胞呈無(wú)序排列；miR-383-3p過(guò)表達(dá)后冠狀動(dòng)脈結(jié)構(gòu)明顯得到改善；而PTEN過(guò)表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)miR-383-3p過(guò)表達(dá)的上述改善作用，見(jiàn)圖4。

圖4 HE染色觀察冠狀動(dòng)脈組織病理變化(HE，比例尺：50μm)

2.5各組大鼠內(nèi)皮細(xì)胞凋亡比較:結(jié)果顯示CHD大鼠內(nèi)皮細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.05)；miR-383-3p過(guò)表達(dá)可顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(P<0.05)；而PTEN過(guò)表達(dá)則可顯著逆轉(zhuǎn)miR-383-3p對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用(P<0.05)，見(jiàn)圖5、6。

圖5 各組大鼠內(nèi)皮細(xì)胞凋亡比較注：與control組相比，aP<0.05；與CHD組相比，bP<0.05；與miR-383-3p mimic組相比，cP<0.05

圖6 各組大鼠內(nèi)皮細(xì)胞凋亡比較(TUNEL，比例尺：50μm)

2.6各組大鼠冠狀動(dòng)脈組織Bcl-2、Bax表達(dá)比較:通過(guò)Western blot檢測(cè)冠狀動(dòng)脈組織Bcl-2、Bax表達(dá)情況，結(jié)果顯示CHD大鼠冠狀動(dòng)脈組織Bax表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)顯著減少(P<0.05)；miR-383-3p過(guò)表達(dá)顯著降低Bax表達(dá)(P<0.05)，顯著增加Bcl-2表達(dá)(P<0.05)；而PTEN過(guò)表達(dá)則可顯著逆轉(zhuǎn)miR-383-3p對(duì)上述蛋白表達(dá)的影響(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

圖7 各組大鼠冠狀動(dòng)脈組織Bcl-2、Bax表達(dá)比較注：與control組相比，aP<0.05；與CHD組相比，bP<0.05；與miR-383-3p mimic組相比，cP<0.05

2.7miR-383-3p與PTEN靶向關(guān)系驗(yàn)證:TargetScan預(yù)測(cè)顯示：miR-383-3p與PTEN存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖9(a)；為探究miR-383-3p對(duì)PTEN調(diào)控作用，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對(duì)miR-383-3p與PTEN靶向關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示miR-383-3p過(guò)表達(dá)可顯著降低熒光素酶相對(duì)活性(P<0.05)，見(jiàn)圖9(b)，并且顯著降低PTEN蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，見(jiàn)圖8(c)、(d)。

圖8 miR-383-3p與PTEN靶向關(guān)系驗(yàn)證a， miR-383-3p與PTEN結(jié)合位點(diǎn)；b，熒光素酶相對(duì)活性比較(與PTEN-wt+mimic NC組相比，aP<0.05。)；c， miR-383-3p過(guò)表達(dá)對(duì)PTEN蛋白表達(dá)的影響；d Western blot檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)的量化圖

圖9 各組大鼠冠狀動(dòng)脈組織PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達(dá)比較注：與control組相比，aP<0.05；與CHD組相比，bP<0.05；與miR-383-3p mimic組相比，cP<0.05

2.8各組大鼠冠狀動(dòng)脈組織PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達(dá)比較:通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠冠狀動(dòng)脈組織PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示CHD大鼠冠狀動(dòng)脈組織PTEN表達(dá)顯著升高(P<0.05)，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表達(dá)顯著減少(P<0.05)；miR-383-3p過(guò)表達(dá)顯著降低PTEN表達(dá)(P<0.05)，顯著增加p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表達(dá)(P<0.05)；而PTEN過(guò)表達(dá)則可顯著逆轉(zhuǎn)miR-383-3p過(guò)表達(dá)對(duì)p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表達(dá)的促進(jìn)作用(P<0.05)，見(jiàn)圖9。

3 討 論

CHD是一種威脅人類健康的常見(jiàn)心血管疾病，其發(fā)生與內(nèi)皮細(xì)胞損傷等AS過(guò)程密切相關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、長(zhǎng)期高脂血癥及炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，致使脂質(zhì)進(jìn)入動(dòng)脈內(nèi)膜下，逐漸演變成AS斑塊，最終導(dǎo)致CHD發(fā)生[10]。因此，拮抗內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)CHD治療具有重要意義。

miRNA廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的調(diào)控，與冠狀動(dòng)脈疾病、AS、心肌梗塞等多種心血管疾病的發(fā)生有關(guān)[4,10]。miR-383-3p作為miRNA成員之一，被發(fā)現(xiàn)在AS大鼠心肌組織中表達(dá)下調(diào)，其過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制白介素1受體Ⅱ表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)，抑制冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活及血管構(gòu)建[4]。炎癥反應(yīng)時(shí)巨噬細(xì)胞中激活的缺氧誘導(dǎo)因子1α可通過(guò)抑制miR-383表達(dá)增加腺苷三磷酸消耗，增加細(xì)胞壞死性凋亡，從而促進(jìn)AS小鼠病變進(jìn)程[11]。但目前關(guān)于miR-383-3p在CHD中的影響機(jī)制研究甚少，而本研究發(fā)現(xiàn)，miR-383-3p在CHD大鼠冠狀動(dòng)脈組織中表達(dá)明顯降低，與前人研究相一致[4]，表明miR-383-3p參與大鼠CHD的發(fā)生。在生理狀態(tài)下，NO/ET處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)發(fā)生血管內(nèi)皮損傷時(shí)，調(diào)控血管收縮的ET及AngⅡ水平顯著增加，而具有維持血管穩(wěn)態(tài)作用的NO水平顯著降低[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-383-3p過(guò)表達(dá)可顯著增加HDL-C、VEGF、NO水平、Bcl-2表達(dá)水平，減少TG、LDL-C、TC、ET-1、AngⅡ水平、冠狀動(dòng)脈組織病理?yè)p傷程度、內(nèi)皮細(xì)胞AI、Bax表達(dá)，該結(jié)果表明，miR-383-3p過(guò)表達(dá)能夠有效降低CHD大鼠血脂水平及冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及病理?yè)p傷，有作為CHD潛在治療靶點(diǎn)的潛能。

PI3K作為一種磷脂酰肌醇激酶，可通過(guò)磷酸化為PIP3來(lái)激活A(yù)kt和下游效應(yīng)器mTOR，以此參與細(xì)胞存活及凋亡，而其上游因子PTEN則可將PIP3去磷酸化為PIP2，因此被作為PI3K拮抗劑[13]。有報(bào)道稱，miR-26a-5p可通過(guò)靶向PTEN激活PI3K/Akt通路，促進(jìn)冠狀動(dòng)脈疾病小鼠內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[6]。三氯生可通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR通路刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)損傷[14]。本研究生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PTEN是miR-383-3p的靶向基因，miR-383-3p過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制CHD大鼠冠狀動(dòng)脈組織中PTEN表達(dá)，促進(jìn)p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表達(dá)，該結(jié)果表明miR-383-3p能夠通過(guò)抑制PTEN表達(dá)激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路。猜測(cè)miR-383-3p過(guò)表達(dá)對(duì)CHD大鼠冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的抑制作用是否可能與其調(diào)控該通路有關(guān)，基于此猜想，本研究在miR-383-3p過(guò)表達(dá)基礎(chǔ)上對(duì)PTEN進(jìn)行過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)，PTEN過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-383-3p高表達(dá)對(duì)CHD大鼠內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及功能損傷的改善作用，該結(jié)果表明，miR-383-3p可通過(guò)靶向抑制PTEN表達(dá)激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，從而起到抑制CHD大鼠內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善內(nèi)皮損傷的作用。

綜上所述，miR-383-3p可通過(guò)靶向抑制PTEN表達(dá)來(lái)激活/PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，從而起到抑制CHD大鼠內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。本研究為CHD治療靶點(diǎn)的尋找提供了新方向。本研究目前僅限于大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對(duì)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還有所欠缺，因此，在后續(xù)會(huì)繼續(xù)深入。