兼具抗菌及促細胞黏附特性的鈦表面光熱涂層的研究

陸軍 曾德良

光熱療法（PTT）被視為一種替代抗生素的細菌感染控制策略[1-2]。光熱納米顆粒在適當的近紅外光（NIR）輻照下被激活，可局部釋放熱量[3]。PTT 的顯著優勢就是抗菌效果具有較強的普適性，對菌株的革蘭氏菌特征或抗生素耐藥性沒有明顯區分。臨床上，細菌感染很少由浮游細菌引起，主要由生物膜生長模式中的細菌引起，細菌通過基質產生黏附并適應基質表面[4]。植入物術后感染，如因侵入性手術或創傷引起的感染[5]，是生物材料植入失敗的主要原因，因為植入物相關感染難以用抗生素等抗菌藥物有效控制[6]。據報道，基于光熱納米顆粒的PTT 技術需要將其富集到感染部位并進行近紅外輻射，方能產生更好的效果[7-9]。若將光熱納米顆粒用作植入物的涂層，則可保證光熱納米顆粒直接接觸感染部位，從而提升PTT 療效，有效控制感染。然而，通過近紅外輻射殺死植入物表面上的細菌對植入物周圍的細胞及組織也可能造成附帶損害。尋求植體表面的抗菌光熱涂層，同時也須強調涂層對周圍細胞黏附及組織整合的保護與促進作用。本研究中，我們在鈦表面制備了可被NIR 激活的聚多巴胺納米顆粒（PDA-NP）涂層，進一步驗證了其用于預防和治療生物材料相關感染并維持組織整合的潛能。臨床上，植入物組織整合的成敗受到金黃色葡萄球菌（S.aureus）感染的挑戰，因此本研究選擇S.aureus 作為病原體，因其是種植體周圍炎的主要致病病原體[10]。PDA-NP 具有良好的生物相容性、生物降解能力和較強的近紅外吸收能力而被選擇用作鈦表面涂層[11-13]。本研究通過細菌和細胞共培養的模型評估鈦表面的PDA-NP 涂層殺菌效果和細胞黏附效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

直徑10 mm、厚度1 mm 的生物醫用級Ti6Al4V圓盤材料（中國寶雞君航金屬材料有限公司）。NH4OH，無水乙醇，KOH 和鹽酸多巴胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。FITC-phalloidin、DAPI 和CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。小鼠前成骨細胞系（MC3T3-E1）購自中科院細胞庫。

掃描電子顯微鏡（復納科學儀器上海有限公司），紅外成像攝像機（Fluke TiX580，荷蘭），多功能全波長微孔板讀取器（Multiskan GO，Thermo Fisher Scientific，美國），熒光顯微鏡拍照分析（Leica DM4000，Leica Microsystems Ltd.，德國）。

1.2 方法

1.2.1 鈦表面光熱PDA-NP 涂層的制備及其表征

鈦表面首先經堿熱處理：將鈦片置于含有4 mol/L的KOH 溶液的反應釜中，80 ℃恒溫反應2 h，自然冷卻至室溫，取出鈦片，去離子水沖洗后干燥，處理完后的鈦片標記為Ti。

在堿熱處理后的鈦表面合成光熱納米顆粒PDA-NP：7 mL NH4OH（28%～30%）與40 mL 無水乙醇和90 mL 超純水室溫下攪拌30 min。然后，向溶液中添加10 mL 多巴胺（50 mg/mL）溶液，并在30℃下攪拌24 h，將上述Ti-OH 鈦片置于溶液內以形成PDA 納米顆粒。用96%乙醇洗滌3 次，并用去離子水清洗3 次，在60 ℃的烘箱中干燥樣品。處理后的鈦片標記為Ti-PDA。

使用掃描電子顯微鏡（SEM），加速電壓10 kV，檢測鈦樣品上PDA-NP 涂層的形貌。表面噴涂10 nm厚的金層。

1.2.2 鈦表面PDA-NP 涂層的光熱效應

為了確定鈦表面PDA-NP 涂層的光熱效應，在808 nm（Thorlabs，Newton，NJ）下以1 W/cm2的功率密度進行近紅外輻射3 min。在輻照期間，使用紅外成像攝像機記錄溫度，完成整個樣品表面成像。

1.2.3 細胞培養

使用小鼠前成骨細胞系（MC3T3-E1）對Ti-PDA 進行體外評價，并與Ti 進行比較。在37 ℃下，使用含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素的α-MEM 培養基在加濕環境中，37 ℃和5% CO2條件下培養細胞。樣品在121 ℃下高壓滅菌20 min，并放置在24 孔培養板中進行細胞接種。

1.2.4 細胞黏附

每個樣品上接種1×105個細胞，培養12 h 后，固定細胞，梯度脫水干燥，掃描電鏡成像。

1.2.5 細胞增殖

將MC3T3-E1 細胞以5×104細胞/樣品的密度接種在24 孔板中的樣品上，分別培養1、3 和7 d。在每個時間點，根據說明書加入CCK-8 工作液，并在37 ℃下培養2 h，在450 nm 處讀取光密度值。

1.2.6 抗菌效果

1.2.6.1 光熱抗菌效果

為了進行光熱殺菌，將金黃色葡萄球菌ATCC12600 菌液稀釋至5×104個細菌/mL 的濃度。向含有PDA-NP 涂層鈦樣品（Ti-PDA）的24 孔板中添加1 mL 細菌懸浮液，葡萄球菌黏附于PDA-NP涂層鈦表面。1 h 后，PBS 洗滌樣品并轉移到新的孔中，進行3 min 的NIR 輻照。輻照后，將樣品進行超聲后，取表面黏附細菌，置于血液瓊脂平板，37 ℃下培養48 h，然后計數所形成的菌落單位（CFU）。

1.2.6.2 光熱抗菌對細胞黏附的影響

為了模擬手術植入過程中的污染，取1 mL 葡萄球菌懸液（5×104個細菌），接種在24 孔板中的樣本表面。1 h 后，將樣品轉移到新孔中，PBS 洗滌3次。隨后，將500 μL MC3T3-E1 懸浮液（1×105個細胞）接種在樣本表面，37 ℃和5% CO2下培養2 h后，以1 W/cm2的功率進行3 min 的近紅外輻照（808 nm）。培養24 h 后，進行FITC-phalloidin 和DAPI 染色，并使用熒光顯微鏡拍照分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 鈦表面涂層的制備

SEM 觀察顯示，經過堿熱處理的Ti 表面形成了均勻一致的多孔結構，而Ti-PDA 表面明顯展示出與Ti 不同的表面結構（圖1），可見PDA 粒子在涂層中的聚集。

圖1 SEM 圖像：Ti 和Ti-PDA 的表面形貌Fig.1 SEM images: Surface morphology of Ti and Ti-PDA

2.2 鈦表面涂層的光熱效果

Ti 表面經NIR 輻照3 min 后，發生了接近4 ℃的輕微的光-熱轉換（圖2）。相同條件下，Ti-PDA 的溫度升高了約30 ℃。

圖2 Ti 和Ti-PDA 上808 nm（1 W/cm2）下NIR輻照3 min 后成像Fig.2 Irradiation imaging at 808 nm (1 W/cm2)for 3 min of NIR on Ti and Ti-PDA

2.3 鈦表面涂層對細胞黏附的影響

接種早期的細胞的黏附和遷移對于之后的生長、增殖和分化至關重要。本研究中，MC3T3-E1 在Ti 和Ti-PDA 上培養12 h 后進行掃描電鏡，結果顯示MC3T3-E1 與兩組鈦基質結合均良好，細胞呈多邊形，而Ti-PDA 組的鈦表面細胞鋪展更好，細胞聚集生長（圖3）。

圖3 細胞黏附：在Ti 和Ti-PDA 上培養12 h 的MC3T3-E1 細胞的SEM 照片Fig.3 Cell adhesion: SEM images of MC3T3-E1 cells cultured on Ti and Ti-PDA for 12 h

2.4 鈦表面涂層對細胞增殖的影響

CCK-8 結果（圖4）表明，在生長1、3 d 后，與對照組（CON）相比，Ti 和Ti-PDA 組均無顯著差異。但在第7 天，Ti-PDA 樣品的細胞增殖明顯高于Ti 組和對照組（P＜0.001）。

圖4 不同樣本表面分別培養1、3、7 天的MC3T3-E1 細胞增殖情況（***：P＜0.001）Fig.4 The proliferation of MC3T3-E1 cells on the surface of different samples cultured for 1,3,7 days respectively(***: P＜0.001)

2.5 鈦表面涂層的抗菌效果

Ti 抑制細菌生長的能力有限，而在Ti-PDA 中可以清楚地觀察到有效的生長抑制現象（圖5A），Ti-PDA 中S.aureus 的菌落數明顯小于Ti 組（圖5B）。

圖5 抗菌活性檢測（***：P＜0.001）Fig.5 Antibacterial activity examination (***: P＜0.001)

在模擬手術植入過程的污染模型中（圖6A），當用NIR 照射至少3 min 后，Ti-PDA 組可見明顯的細胞黏附，說明涂層可以在植入之前對黏附的葡萄球菌進行光熱殺滅，從而顯著改善細胞黏附（圖6B）。

圖6 MC3T3-E1 細胞與光熱抗菌涂層的相互作用Fig.6 The interaction between MC3T3-E1 cells and the photothermal antibacterial coating

3 討論

為了提高細胞在材料表面的黏附和生長，眾多研究在植入材料表面制備納米圖形特征[14-15]。然而，部分研究結果適用性低、過于復雜和不實用的生產過程以及高制造成本，無法真正應用于臨床。因此，在臨床植入物表面產生納米形貌的新技術開發應側重于將功能性與適用性相結合。PDA 納米涂層因其易操作性和良好的生物相容性、可降解性，近年來受到越來越多的關注。

光熱治療不僅可以作為每次手術階段的感染預防措施，也可以作為術后階段的感染治療措施。在每次手術的早期，光熱治療可以殺死手術早期可能污染植入物表面的細菌，而散熱引起的組織損傷并不重要[16-17]。而在術后階段，使用光熱治療必須考慮散熱引起的組織損傷。因此本研究從預防散熱導致的損傷出發，在植入物表面增加具有良好細胞黏附性能的光熱抗菌涂層，成功制備出Ti-PDA 樣品。

雖然鈦基合金是最常用的生物醫學植入材料，但其固有的惰性并不能促進植入物表面與周圍骨的牢固結合。鈦合金不能增強宿主組織中成骨細胞的成骨活性是導致種植體松動的主要原因[18-19]。本研究中，Ti-PDA 顯示出優異的促成骨細胞黏附和增殖的能力，有望顯著促進植體的骨整合效果。

4 結論

研究證實，具有聚多巴胺納米粒子光熱涂層的生物植入物Ti-PDA 具有良好的生物相容性，能夠促進成骨細胞的增殖；同時，該涂層在光熱效果下具有良好的抗菌性能，殺死污染表面的細菌并同時有效維持細胞黏附，促進組織整合。