ANA-12在大鼠坐骨神經慢性壓迫性損傷中對星形膠質細胞活化和自噬的作用*

李珍，譚志榮，徐偉，陳亮

（1.湖南省婦幼保健院 麻醉科，湖南 長沙 410008；2.中南大學湘雅醫(yī)院 遺傳藥理學科，湖南 長沙 410008）

神經性疼痛通常被定義為軀體感覺神經系統(tǒng)（無論是外周還是中樞）損傷或功能障礙引起的疼痛，是一種復雜的疼痛障礙［1］。脊髓星形膠質細胞在誘導和維持神經性疼痛中起著關鍵作用［2］。神經性疼痛總是伴隨著脊髓星形膠質細胞的激活［3］。星形膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)中最豐富的細胞，與神經元突觸形成密切相關［4］。星形膠質細胞之間以及小膠質細胞和神經元之間的相互作用現在被認為是急性和慢性疼痛狀態(tài)的基本機制［5］。因此，了解星形膠質細胞中的細胞內信號傳導對于尋找神經性疼痛的治療策略至關重要。

自2011 年被發(fā)現以來，ANA-12 已成為研究星形膠質細胞功能障礙與疼痛超敏反應的關鍵工具［6-7］。ANA-12 阻斷BDNF 信號可降低脊髓炎癥并緩解急性痛和慢性痛［8］。然而，ANA-12 在神經性疼痛相關星形膠質細胞中的作用機制尚不清楚。目前，利多卡因等藥物已被證明能激活星形膠質細胞的自噬，從而改善慢性收縮損傷誘導的坐骨神經疼痛［9］，但均具有一定程度的副作用。因此，本研究致力于探究ANA-12 在大鼠坐骨神經慢性壓迫性損傷中對星形膠質細胞活化和自噬的作用，以期為ANA-12 在大鼠坐骨神經慢性壓迫性損傷中的應用提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ANA-12（0.05 mg，219766-25-3，Sigma，美國）；膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體（1∶50，60190-1-Ig，Proteintech，美國）；LC3B 抗體（1∶50，18725-1-AP，Proteintech，美國）；CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L，SA00013-1，Proteintech，美國）；CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L，SA00013-4，Proteintech，美國）；其它常規(guī)化學試劑購自上海國藥生物。

1.2 儀器與設備

光學顯微鏡（BA410T，Motic，中國）；切片機（YD-315，浙江金華益迪試驗器材，中國）；包埋機（BMJ-A，常州中威電子儀器，中國）；足底觸痛儀（熱刺痛，ZS-PTM，北京眾實迪創(chuàng)，中國）；足底刺痛系統(tǒng)（針刺痛，ZS-CTY，北京眾實迪創(chuàng)，中國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物與分組處理 18 只成年Sprague Dawley（SD）大鼠（雄性，體重150～180 g）購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。大鼠隨機分為假手術組、CCI 組（坐骨神經慢性壓迫性損傷大鼠模型組）和ANA-12 組（坐骨神經慢性壓迫性損傷大鼠+0.5 mg/kg ANA-12 干預組），每組6 只，其中假手術組僅暴露坐骨神經，其余兩組造成坐骨神經慢性壓迫性損傷（chronic constrictive injury,CCI）疼痛模型。ANA-12 組大鼠腹腔注射0.5 mg/kg ANA-12，每天1 次，連續(xù)14 d，術后立即給予第一次劑量。CCI 造模后14 d，頸椎脫臼處死大鼠，四肢固定，使胸腔完全暴露。大鼠主動脈通過左心室插管，采用0.9%生理鹽水溶液（200 mL）灌注心臟，然后分離大鼠脊髓組織。脊髓組織用4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋，每塊組織連續(xù)切片，用于免疫熒光組化檢測。

1.3.2 動物模型制備 建立大鼠CCI 模型。每只大鼠于手術前腹腔注射30 mg/kg 戊巴比妥鈉麻醉。皮膚預備后，沿右側股骨下緣中部約作1 cm 切口。坐骨神經暴露于肌肉的鈍性分離。然后用4-0縫合線在1 mm 間隔內形成4 個松結。外膜輕度受壓，腳趾輕微抽搐。隨后，常規(guī)縫合肌筋膜和皮膚。如果造模后大鼠出現跛行，右側后肢出現輕度外翻，有舔、吊等后肢保護行為，說明CCI 模型建立成功。假手術組坐骨神經暴露2～3 min，不打結，縫合肌筋膜和皮膚。

1.3.3 痛閾測定 于CCI 模型建立后第0、3、5、7、14 天測定機械性反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）和熱收縮潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）。安靜大鼠右后肢足底逐漸加壓，直至出現回避腿舉升反應。記錄最大壓力（縮足閾值），以克表示。實驗重復6次，間隔5 min。去除最大值和最小值后，將MWT 計算為4 個值的平均值±標準差。用自動足底試驗測量大鼠損傷側的TWL 值。儀器發(fā)射紅外光照射大鼠右后肢足底。儀器自動切斷熱量供應，記錄從輻照開始到腳收縮逃逸發(fā)生的時間（潛伏期）。實驗重復6 次，間隔10 min。除去最大值和最小值后，將TWL 計算為4 個值的平均值±標準差。

1.3.4 免疫熒光組織化學 60℃烤片12 h。切片脫蠟、抗原修復。切片依次進行硼氫化鈉溶液浸泡、75% 乙醇溶液浸泡、蘇丹黑染液染色和5%BSA 封閉。滴加適當稀釋的一抗LC3B（1∶50）和GFAP（1∶50），4℃過夜。PBS 沖洗5 min×3 次。然后滴加 50～100 μL CoraLite488 -conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse/Rabbit IgG 抗體，37℃孵育60～90 min，PBS 沖洗5 min×3 次。DAPI 工作液37℃染核10～20 min，PBS 沖洗5 min×3 次。緩沖甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學方法

本研究資料統(tǒng)計分析均采用Graphpad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（）表示，首先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，檢驗符合正態(tài)分布且方差齊，組間采用非配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或重復測量數據的方差分析，Tukey's 進行事后檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠患側機械性反射閾值測定結果

假手術組大鼠的MWT 值在術后第5 天略有降低，之后恢復，與術前相比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。CCI 大鼠的MWT 值在術后3、5、7 天逐步下降，至第14 天，與術前相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。在第3 天，與假手術組相比，CCI 組大鼠的MWT 顯著降低（t=6.524,P＜0.001），ANA-12 干預使CCI 大鼠的MWT 值升高但差異無統(tǒng)計學意義（t=2.088,P=0.130）。在第5 天，與假手術組相比，CCI 組大鼠的MWT 顯著降低（t=10.490,P＜0.001）。ANA-12組大鼠的MWT 值也顯著高于CCI 組（t=4.541,P＜0.001）。在第7 天，與假手術組相比，CCI 組大鼠的MWT 顯著降低（t=13.050,P＜0.001），ANA-12干預使CCI 大鼠的MWT 值升高但差異無統(tǒng)計學意義（t=0.678,P=0.877）。在第14 天，與假手術組相比，CCI 組大鼠的MWT 顯著降低（t=12.000,P＜0.001）。ANA-12 組大鼠的MWT 值也顯著高于CCI 組（t=8.142,P＜0.001）。見表1。

表1 各組大鼠患側機械性反射閾值（MWT）比較（n=6,）

表1 各組大鼠患側機械性反射閾值（MWT）比較（n=6,）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與CCI 組比較，P＜0.05。

圖1 各組大鼠患側機械性反射閾值（MWT）隨時間變化

2.2 各組大鼠患側熱收縮潛伏期測定結果

假手術組大鼠的TWL 值在術后第3 天略有降低，之后恢復，與術前相比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。CCI 大鼠的TWL 值在術后第3、5、7 天逐步下降，至第14 天，與術前相比差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。與假手術組相比，在第3、5、7、14 天，CCI 組大鼠的TWL 均顯著降低（t=8.056,14.923,14.592,14.660,P＜0.001）。在第3、5、7、14 天，與CCI 組相比，ANA-12 組大鼠的MWT 顯著降低（t=3.962,P=0.001；t=4.622,P＜0.001；t=3.698,P=0.003；t=10.171,P＜0.001）。見表2。

圖2 各組大鼠患側熱收縮潛伏期（TWL）隨時間變化

表2 各組大鼠患側熱收縮潛伏期（TWL）比較（n=6,）

表2 各組大鼠患側熱收縮潛伏期（TWL）比較（n=6,）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與CCI 組比較，P＜0.05。

2.3 各組大鼠脊髓組織GFAP 和LC3B 免疫熒光組織化學結果

與假手術組相比，大鼠脊髓組織星形膠質細胞GFAP 熒光密度在CCI 組顯著增加（q=19.850,P＜0.001）。ANA-12 治療后，CCI 大鼠脊髓組織星形膠質細胞GFAP 熒光密度顯著降低（q=14.120,P＜0.001）。與假手術組相比，CCI 大鼠脊髓組織星形膠質細胞LC3B 熒光密度顯著增加（q=9.000,P=0.002）。ANA-12 治療后，CCI 大鼠脊髓組織星形膠質細胞LC3B 熒光密度顯著升高（q=9.108,P=0.002）。見圖3 和表3。

表3 脊髓組織星形膠質細胞的GFAP 和LC3Ⅱ熒光密度統(tǒng)計（n=6,）

表3 脊髓組織星形膠質細胞的GFAP 和LC3Ⅱ熒光密度統(tǒng)計（n=6,）

注：1）與假手術組比較，P＜0.05；2）與CCI 組比較，P＜0.05。

圖3 脊髓組織星形膠質細胞的GFAP 和LC3Ⅱ熒光信號觀察

3 討論

在外周神經損傷、組織損傷和關節(jié)炎疾病中，脊髓星形膠質細胞從靜止狀態(tài)迅速轉變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，這與慢性疼痛行為密切相關［10］。在慢性疼痛模型中，位于脊髓背角淺層的一組星形膠質細胞控制了機械性疼痛超敏反應的產生［11］。激活的星形膠質細胞調節(jié)炎性介質、神經營養(yǎng)因子、腺苷、趨化因子和神經遞質的釋放，導致持續(xù)性熱痛覺過敏和機械性痛覺過敏［12］。與假手術組相比，CCI大鼠的術后MWT 和TWL 值顯著降低，脊髓組織星形膠質細胞活化水平升高，與前人研究一致。這些研究證明脊髓星形膠質細胞活化與坐骨神經壓迫性損傷疼痛密切相關，可能是治療的潛在靶點。

已知CCI 后脊髓背角突觸體素和GFAP 的表達均明顯增多，兩者可能同時參與了病理性神經痛及其調節(jié)過程［13］。既往的研究證明芍藥苷緩解神經病理性疼痛的機制可能與抑制脊髓小膠質細胞活化有關［14］。ANA-12 治療可減輕大鼠膀胱炎相關的機械性異常疼痛，抑制星形膠質細胞和小膠質細胞的活化，減輕神經炎癥［15］。ANA-12 治療促進了CCI 大鼠術后MWT 和TWL 值的恢復，抑制了脊髓組織星形膠質細胞活化，與前人研究一致。這些研究證明ANA-12 治療有助于調節(jié)坐骨神經壓迫性損傷的病理性神經痛。

自噬是一種主要的細胞內溶酶體清除途徑，涉及溶酶體降解和長壽命蛋白質、氧化損傷蛋白質和功能失調細胞器的循環(huán)［16］。目前的證據表明，自噬可能影響星形膠質細胞的功能［17］。7,8-二羥基黃酮可以通過自噬改善1-甲基-4-苯基-1,2,3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的帕金森模型鼠運動障礙［18］。LC3B 是自噬途徑激活的標記物［19］。在髓母細胞瘤中，ANA-12 已用于研究凋亡、自噬和分化相關細胞內信號和基因表達的調節(jié)［20］。我們的研究顯示CCI 大鼠脊髓組織發(fā)生星形膠質細胞活化和LC3B 表達增加，ANA-12 治療抑制了脊髓組織星形膠質細胞活化但促進了LC3B 的表達，可能是ANA-12 改善坐骨神經壓迫性損傷相關神經疼痛的潛在作用機制。

總之，ANA-12 治療通過抑制星形膠質細胞的過度活化和促進LC3B 自噬進而改善大鼠坐骨神經慢性壓迫性損傷的機械和熱縮足痛閾值，緩解了神經性疼痛，為坐骨神經慢性壓迫性損傷的治療提供了新的依據。